了解細(xì)菌革蘭氏染色原理,并掌握其方法。
二、原理
革蘭氏染色法是一種重要的鑒別細(xì)菌的方法,根據(jù)各種細(xì)菌對這種染色法的反應(yīng)不同,可把細(xì)菌分為革蘭氏陽性和革蘭氏陰性兩大類。因此,該方法對于細(xì)菌的分類,鑒定及生產(chǎn)應(yīng)用都有重要意義。其染色原理是利用細(xì)菌的細(xì)胞壁組成成分和結(jié)構(gòu)的不同,革蘭氏陽性菌的細(xì)胞壁肽聚糖層厚,交聯(lián)而成的肽聚糖網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)致密,經(jīng)乙醇脫色處理發(fā)生脫水作用,使孔徑縮小,通透性能降低,結(jié)晶紫與碘形成的大分子復(fù)合物保留在細(xì)胞內(nèi)而不被脫色,結(jié)果使細(xì)胞呈現(xiàn)紫色;而革蘭氐陰性菌肽聚糖層薄,網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)交聯(lián)少,脂類含量較高,經(jīng)乙醇處理后,脂類被溶解,細(xì)胞壁孔徑變大,通透性增加,結(jié)晶紫與碘的復(fù)合物被溶出細(xì)胞壁,使細(xì)胞脫色。此時(shí),再經(jīng)復(fù)紅或沙黃等紅色染料復(fù)染細(xì)胞呈紅色。
在革蘭氏染色中,有兩個(gè)值得注意的問題。一是酒精脫色的時(shí)間要掌握恰當(dāng),隨涂片
厚薄不同,脫色的時(shí)間也不完全一樣,一般以不溶出色素為止。若脫色過度則陽性菌被誤染為陰性菌,而脫色不夠時(shí)陰性菌則被誤染為陽性菌。二是培養(yǎng)物的老幼對染色結(jié)果也有影響,革蘭氏染色檢查的菌,必須是新培養(yǎng)物。
三、材料
1.菌種 培養(yǎng)10~12h的枯草桿菌及大腸桿菌。
2.儀器及其他 顯微鏡、接種環(huán)、酒精燈、載玻片、玻片架、75%酒精消毒缸、鑷子、無菌水、草酸銨結(jié)晶紫、Lugol氏碘液、95%灑精、蕃紅染液、吸水紙、特種蠟筆。
四、方法與步驟
1.涂片 涂片、干燥、固定同簡單染色法。
2.初染 滴加草酸銨結(jié)晶紫于涂片部位,染色時(shí)間為1min。
3.水洗 用水輕輕沖洗,洗去多余的染料。
4.滴加Lugol氏碘液1~2min,紫色部分變黑為止。
5.水洗 傾去Lugol氏碘液水洗。
6.脫色 滴加95%以上的酒精,約30〜60s (色素不溶出為止)。
7.水洗 同5水洗。
8.復(fù)染 滴加蕃紅或沙黃染1~2min。
9.水洗 同5水洗。
10.干燥 自然干燥或用吸水紙吸干。
11.鏡檢 用油鏡觀察,記錄結(jié)果。