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培養(yǎng)基的購置與驗(yàn)收
1.1 購置
從培養(yǎng)基自身的質(zhì)量來看，不同生產(chǎn)廠家的產(chǎn)品，甚至同一廠家不同批號(hào)的產(chǎn)品都會(huì)存在差異。依據(jù)ISO/IEC17025《檢測(cè)和校準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室能力的通用要求》，對(duì)培養(yǎng)基的供應(yīng)企業(yè)進(jìn)行評(píng)價(jià)后選擇合格的供應(yīng)商，這是培養(yǎng)基購買過程中重要的步驟。應(yīng)選擇產(chǎn)品市場(chǎng)信譽(yù)度高、有質(zhì)量保證能力和服務(wù)保證能力的企業(yè)；企業(yè)是否通過了質(zhì)量管理體系的認(rèn)證是較為客觀的評(píng)價(jià)指標(biāo)。
要求生產(chǎn)企業(yè)提供：培養(yǎng)基成分名稱及產(chǎn)品編號(hào)、批號(hào)、使用前的pH、儲(chǔ)藏信息和有效期、性能評(píng)價(jià)和所用測(cè)試菌株、技術(shù)數(shù)據(jù)清單、質(zhì)控證書以及必要的安全/危害數(shù)據(jù)等材料。
1.2 驗(yàn)收
購買的培養(yǎng)基到貨后，應(yīng)有專人做好接受和驗(yàn)收工作，應(yīng)仔細(xì)核對(duì)生產(chǎn)企業(yè)提供的資料、培養(yǎng)基名稱、規(guī)格數(shù)量、外觀特征、批號(hào)、保質(zhì)期是否符合要求。每批培養(yǎng)基到貨后都應(yīng)對(duì)培養(yǎng)基的質(zhì)量進(jìn)行檢測(cè)，滿足檢測(cè)方法規(guī)定的要求后方可投入使用。
培養(yǎng)基的儲(chǔ)存
干粉培養(yǎng)基應(yīng)保存在陰涼干燥處，要避免陽光直射；未開瓶的培養(yǎng)基在室溫下的保存期限以廠家提供為準(zhǔn)，開瓶后的干粉培養(yǎng)基易吸濕，應(yīng)注意防潮并盡快用完。
應(yīng)定期對(duì)儲(chǔ)存中的培養(yǎng)基進(jìn)行常規(guī)檢查，如容器密閉性復(fù)查、首次開封日期、內(nèi)容物的感官檢查，如果培養(yǎng)基發(fā)生結(jié)塊、顏色異常和其他變質(zhì)跡象就不能再使用。
培養(yǎng)基的制備
3.1 培養(yǎng)基用水
培養(yǎng)基制備用水應(yīng)使用電阻率不小于30萬Ωcm的蒸餾水或與其同質(zhì)的水，最好不使用離子交換器生產(chǎn)的去離子水。
3.2 稱量
稱量時(shí)要用專用的角匙，避免交叉污染而影響檢驗(yàn)結(jié)果；干粉培養(yǎng)基易吸潮，如有條件，盡量在濕度較低的房間稱取培養(yǎng)基。
3.3 復(fù)水
復(fù)水時(shí)不得用銅鍋或鐵鍋，以防有離子混入培養(yǎng)基中，影響微生物的生長；容器的大小需大于復(fù)水后培養(yǎng)基總體積的2倍以上，避免在加熱溶解過程中，培養(yǎng)基溢出；含有瓊脂粉的培養(yǎng)基，在加熱溶解之前可以浸泡數(shù)分鐘；加熱培養(yǎng)基時(shí)一定要進(jìn)行攪拌，特別是瓊脂類培養(yǎng)基。為避免燒焦和沸騰溢出，對(duì)于少量的培養(yǎng)基最好使用沸水浴進(jìn)行加熱。
燒糊的培養(yǎng)基營養(yǎng)物質(zhì)被破壞，并可產(chǎn)生有毒物質(zhì)，如發(fā)現(xiàn)焦化，或未溶解均勻前培養(yǎng)基有溢出，該培養(yǎng)基即不能使用，應(yīng)重新制備。對(duì)于瓊脂類培養(yǎng)基進(jìn)行再融化時(shí)應(yīng)使用沸水浴或流動(dòng)蒸汽進(jìn)行加熱，最多只能加熱兩次，第二次再融化后仍未用完的培養(yǎng)基應(yīng)棄去。
3.4 滅菌
一般培養(yǎng)基采用濕熱滅菌，即高壓蒸汽滅菌，通常是121℃ 15 min，含糖或特殊培養(yǎng)基，按照國家標(biāo)準(zhǔn)或生產(chǎn)商提供的說明滅菌。已配制好的培養(yǎng)基必須立即滅菌，避免微生物生長繁殖而消耗養(yǎng)分，改變培養(yǎng)基的酸堿度。
高溫可破壞培養(yǎng)基的營養(yǎng)成分，還會(huì)使瓊脂的凝膠強(qiáng)度下降，因此必須嚴(yán)格控制滅菌溫度和時(shí)間，并且不可重復(fù)滅菌。高壓蒸汽滅菌鍋的壓力表等要定期進(jìn)行檢定，并定期采用生物指示菌法或化學(xué)變色紙片對(duì)滅菌效果進(jìn)行驗(yàn)證。
3.5 pH測(cè)定
微生物必須在適宜的pH范圍內(nèi)才能正常生長繁殖或體現(xiàn)其生物特性。培養(yǎng)基配方要求的pH為滅菌或消毒后的pH值，即培養(yǎng)基使用前的pH，并應(yīng)在25℃溫度下采用精密酸度計(jì)進(jìn)行測(cè)量，固體瓊脂培養(yǎng)基應(yīng)以特殊的膠體表面測(cè)量電極進(jìn)行測(cè)量。使用過程中，如果需要調(diào)整培養(yǎng)基的pH，應(yīng)用1mol/L Na0H或 lmol/LHCL調(diào)整，注意不可反復(fù)調(diào)pH，否則會(huì)影響培養(yǎng)基的滲透壓。
3.6 配制好的培養(yǎng)基保存
滅菌以后培養(yǎng)基應(yīng)該迅速冷卻至所需溫度，避免長時(shí)間保存在滅菌鍋內(nèi)，造成過度滅菌，影響培養(yǎng)基的營養(yǎng)成分或選擇性效果。
所配制的培養(yǎng)基的量，應(yīng)該是在最長保存期限內(nèi)正好使用完。含染料的培養(yǎng)基應(yīng)閉光保存；倒好的瓊脂平板如果配制的當(dāng)天未使用完，應(yīng)于冷藏保存，如果保存時(shí)間超過2天，應(yīng)將其放入密封的塑料袋中保存；配好的肉湯類培養(yǎng)基如果保存時(shí)間超過2個(gè)星期，應(yīng)將其放在帶有螺旋蓋的試管或其它密閉的試管或容器中防止蒸發(fā)。
培養(yǎng)基的性能測(cè)試
4.1 外觀控制
制備好的培養(yǎng)基應(yīng)有相應(yīng)的顏色，一般的培養(yǎng)基應(yīng)澄清、無渾濁、無沉淀。使用前應(yīng)檢查培養(yǎng)基的顏色是否發(fā)生變化，是否蒸發(fā)/脫水。
4.2 污染控制
從每批制備好的培養(yǎng)基中選取部分進(jìn)行污染測(cè)試（空白試驗(yàn)），確定無微生物生長方可使用。
4.3 性能測(cè)試
4.3.1 測(cè)試菌株選擇： 測(cè)試菌株是具有其代表種的穩(wěn)定特性并能有效證明實(shí)驗(yàn)室特定培養(yǎng)基最佳性能的一套菌株，應(yīng)來自國際/國家標(biāo)準(zhǔn)菌種保藏中心ATCC標(biāo)準(zhǔn)菌株或其他有證書的菌株。
4.3.2 定量測(cè)試方法： 改良Miles-Misra法。測(cè)試菌株過夜培養(yǎng)物10倍遞增稀釋；測(cè)試平板和參照平板劃分為4個(gè)區(qū)域并標(biāo)記；從最高稀釋度開始，分別滴一滴稀釋液于試驗(yàn)平板和對(duì)照平板標(biāo)記好的區(qū)域；將稀釋液涂滿整個(gè)1/4區(qū)域，37°C培養(yǎng)18小時(shí)；對(duì)易計(jì)數(shù)的區(qū)域計(jì)數(shù)，按公式計(jì)算生長率（生長率=待測(cè)培養(yǎng)基平板上得到的菌落總數(shù)/參考培養(yǎng)基平板上獲得的菌落總數(shù)）。非選擇性培養(yǎng)基上目標(biāo)菌的生長率應(yīng)不低于0.7，該類培養(yǎng)基應(yīng)易于目標(biāo)菌生長；選擇性培養(yǎng)基上目標(biāo)菌的生長率應(yīng)不低于0.1 。
4.3.3 半定量測(cè)試方法：改進(jìn)的劃線法接種法。 平板分ABCD四區(qū)，共劃16條線，平行線大概相隔0.5cm，每條有菌落生長的劃線記作1分，每個(gè)僅一半的線有菌落生長記作0.5分，沒有菌落生長或生長量少于劃線的一半記作0分，分?jǐn)?shù)加起來得到生長指數(shù)G。目標(biāo)菌在培養(yǎng)基上應(yīng)呈現(xiàn)典型的生長，而非目標(biāo)菌的生長應(yīng)部分或完全被抑制，目標(biāo)菌的生長指數(shù)G大于6時(shí)，培養(yǎng)基可接受 。
4.3.4 定性測(cè)試方法 ：平板接種觀察法。 用接種環(huán)取測(cè)試菌培養(yǎng)物，在測(cè)試培養(yǎng)基表面劃平行直線。按標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定的培養(yǎng)時(shí)間和溫度對(duì)接種后的平板進(jìn)行培養(yǎng)，目標(biāo)菌應(yīng)呈現(xiàn)良好生長，并有典型的菌落外觀、大小和形態(tài)，非目標(biāo)菌應(yīng)是微弱生長或無生長 。
另外對(duì)選擇性培養(yǎng)基還應(yīng)選擇被抑制生長的菌株進(jìn)行培養(yǎng)基驗(yàn)收。
附件：教你看懂培養(yǎng)基檢驗(yàn)報(bào)告單（CoA）
干粉類培養(yǎng)基的檢驗(yàn)報(bào)告單主要包括以下內(nèi)容，建議拿一份CoA結(jié)合本文閱讀。
1. 感官
一般包括色澤、氣味、形態(tài)、雜質(zhì)等，屬于主觀評(píng)價(jià)。不同廠家產(chǎn)品會(huì)有不同。
2. 理化
a) 干燥失重或水分
一般控制在5%-6%以內(nèi)，不同廠家會(huì)有不同。結(jié)合水活度來說，這是控制培養(yǎng)基干粉微生物污染的重要手段。同時(shí)要關(guān)注密封情況，不能破壞水活度的環(huán)境。
b) 凝膠強(qiáng)度
這條僅限于是瓊脂類干粉培養(yǎng)基，一般描述為適宜或適中。因?yàn)榄傊桨逡话阋怪门囵B(yǎng)，所以凝膠強(qiáng)度非常重要。而凝膠強(qiáng)度的高低也直接來源于瓊脂的質(zhì)量。瓊脂是一種來源于海藻中，具有自然變異性的生物材料，并不是營養(yǎng)物質(zhì)。主要應(yīng)用于食品和制藥行業(yè)，食品行業(yè)使用量最大，如果凍。細(xì)菌學(xué)瓊脂主要從石花菜中獲取，而目前全球正經(jīng)歷石花菜的短缺。
瓊脂質(zhì)量也用凝膠強(qiáng)度來評(píng)價(jià)。瓊脂類培養(yǎng)基必須達(dá)到規(guī)定的凝膠強(qiáng)度才能實(shí)現(xiàn)穩(wěn)定倒置培養(yǎng)。如果加入的瓊脂本身的凝膠強(qiáng)度小，加入量就要增加。過多的加入瓊脂量不僅造成不必要的浪費(fèi)而且會(huì)造成培養(yǎng)基過硬，直接影響微生物對(duì)營養(yǎng)物質(zhì)的吸收利用，而且培養(yǎng)基過硬時(shí)平板劃線容易產(chǎn)生裂痕，所以有時(shí)候并不是你的技術(shù)問題。從這個(gè)角度來說就很好理解為什么國外的一些標(biāo)準(zhǔn)中培養(yǎng)基的瓊脂用量是一個(gè)范圍，如每升培養(yǎng)基的瓊脂含量為12-20g，其實(shí)是根據(jù)所用瓊脂的凝膠強(qiáng)度不同來決定的。凝膠強(qiáng)度可以用凝膠強(qiáng)度測(cè)定儀直接檢測(cè)。
c)澄清度
溶解之后的澄清度情況，液體培養(yǎng)基尤其要關(guān)注這點(diǎn)。
d)pH值
滅菌后在25℃的pH測(cè)定值。瓊脂類培養(yǎng)基必須采用平頭pH值測(cè)定儀測(cè)定。
3. 微生物
a)回收率
接菌量在10-100cfu/ml，回收率標(biāo)準(zhǔn)同藥典標(biāo)準(zhǔn)。但是要注意對(duì)照培養(yǎng)基不一定是藥典用的中檢院推廣的對(duì)照培養(yǎng)基。有些國外生產(chǎn)培養(yǎng)基的對(duì)照培養(yǎng)基只是前一批次合格產(chǎn)品。
b)質(zhì)控菌
菌落特征要符合標(biāo)準(zhǔn)，菌落顏色、大小、其他特征。生長情況描述為良好或者用+++表示。將質(zhì)控菌稀釋到一定濃度后，使用定量接種環(huán)進(jìn)行四區(qū)劃線后看結(jié)果，第四區(qū)能出現(xiàn)單個(gè)菌落并形態(tài)明顯最好。那+++是不是只代表只生長到第三區(qū)呢？你可以問問你的培養(yǎng)基供應(yīng)商。
c）抑菌情況
分為部分抑制，完全抑制。也是用四區(qū)劃線法，一般部分抑制允許在第一區(qū)有部分菌落存在。但是接菌量有區(qū)別，有些是100-1000cfu/ml有些是1000-10000cfu/ml，要注意不同廠家的產(chǎn)品上會(huì)有說明。單從抑菌情況來說，如果接菌量越大抑制情況都可以達(dá)到越好，但是要結(jié)合生長情況考慮，很多抑菌成分如果過多也會(huì)對(duì)正常生長的菌產(chǎn)生影響。
如何評(píng)價(jià)一份高質(zhì)量的CoA？
1. 結(jié)果有具體數(shù)字，如水分或干燥失重、pH、回收率、凝膠強(qiáng)度等。
2. 在同樣的培養(yǎng)條件下生長情況能達(dá)到四區(qū)劃線都有。
3. 抑制情況是該抑制的都抑制。
4.有配套的MSDS，化學(xué)品安全技術(shù)說明書。
一般的MSDS應(yīng)該包括組分信息、急救措施、消防措施、泄漏應(yīng)急處理、操作處置與儲(chǔ)存、接觸控制和個(gè)體防護(hù)、理化特性、穩(wěn)定性、毒理學(xué)信息、生態(tài)學(xué)信息、廢棄處置等。
從安全操作的角度來說，MSDS告訴你保護(hù)自己和保護(hù)環(huán)境的有用信息。
從穩(wěn)定操作角度來說，MSDS告訴你一瓶開蓋干粉培養(yǎng)基可以放置多久。
從廢物處理角度來說，MSDS告訴你大量干粉應(yīng)該如何處置。
