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微生物檢測中菌懸液不會制備,化驗結(jié)果怎么能保證準確?

放大字體  縮小字體 發(fā)布日期:2022-07-09
核心提示: 對于微生物實驗室的小伙伴們來說,天除了面對接樣,檢測樣品,配培養(yǎng)基等各種瓶瓶罐罐交響曲以外,制備合適濃度的菌懸液應(yīng)
 對于微生物實驗室的小伙伴們來說,ÿ天除了面對接樣,檢測樣品,配培養(yǎng)基等各種瓶瓶罐罐交響曲以外,制備合適濃度的菌懸液應(yīng)該是ÿ天的頭號大事了,畢竟有太多的項目需要合適濃度的菌懸液,產(chǎn)品方法適用性,培養(yǎng)基促生長測試,最要命的是ÿ天產(chǎn)品檢測中的陽性對照菌菌懸液的制備。

 


操作流程

 

 

這里以大家最常用的大腸埃希菌為例,其它菌種方法類似。

 

1.   菌種制備
 


 

從菌種保藏管中吸取少量菌液,轉(zhuǎn)接到新鮮的TSB中,于30℃-35℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18-24小時。

 

2.   稀釋
 


 

取步驟1的培養(yǎng)物1ml,加入到9ml的pH7.0 氯化鈉蛋白質(zhì)緩沖液中,進行倍比稀釋。

 

 

3.   平板計數(shù)
 


 

取稀釋好的菌液,一般取3個稀釋級,ÿ個梯度取2ml,分別加入兩塊90cm的平皿中,ÿ皿加入1ml菌液,傾注45℃左右的已經(jīng)經(jīng)過確定的TSA培養(yǎng)基,輕輕搖勻,靜置,培養(yǎng)基凝固后,置30-35℃培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)48小時。

4.  菌落計數(shù)
 


 

將培養(yǎng)后的平板,置于菌落計數(shù)器下進行菌落計數(shù),以確定哪個稀釋級的濃度能夠滿足測試的要求。

   


注意事項

菌種制備

也可以使用TSA平板進行培養(yǎng),如果轉(zhuǎn)接的是冷凍保藏管中的菌,最好再轉(zhuǎn)接一次,使用第二次轉(zhuǎn)接的菌種。

 

稀釋

取菌液的時候,需要先對菌液進行振蕩或吹打混勻,方可吸取菌液?梢圆挥眠M行倍比稀釋,只要能保證最后加入到測試樣品中的菌的數(shù)量符合要求即可。

 

平板計數(shù)

取菌液時同樣需要先將試管中的菌液進行混勻。

 

培養(yǎng)基菌落計數(shù)

不建議逐日觀察結(jié)果,因為平板中可能有凝集水, 逐日觀察拿動平板,可能會導(dǎo)致水落到菌落上,菌跟著水流到下一個空白地方,導(dǎo)致結(jié)果不準確;另外如果是ù菌,因為有孢子,拿動也會導(dǎo)致孢子落到平板空白地方,影響結(jié)果。

 


事后思考

 

1.   菌液的使用

 

菌懸液使用有時效性要求

 

2015版<中國藥典>和<歐洲藥典>8.0版要求如果放置在室溫,菌懸液必須在2小時內(nèi)使用,如果放置在2-8℃保存,可以在24小時內(nèi)使用。

 

那ô問題來了,菌懸液的菌的數(shù)量需要在48小時后才能確定,但是在24小時之內(nèi)菌懸液必須使用,所以在不知道菌含量的情況下,樣品測試需要做至少三個梯度。

 

筆者之前在微生物實驗室做了5次的菌懸液制備,為了保證實驗的成功,ÿ次都是要做三個梯度,雖然大多數(shù)都是同一個稀釋級的含量符合要求,但是還是偶爾有另一個稀釋級才符合要求的時候,所以筆者ÿ次都乖乖的做三個梯度的測試,還好筆者那個時候依據(jù)的法規(guī)中,日常的無菌檢查和控制菌檢查中û有陽性對照的要求。

 

這里說的三個梯度不是說只是計數(shù),而是菌懸液實際運用的測試中也需要三個梯度,舉個例子,某個無菌產(chǎn)品無菌檢查中的陽性對照測試,需要做三個對照。當(dāng)然,同樣的產(chǎn)品方法適用性,培養(yǎng)基促生長測試也是如此。流程圖如下:

 

2. 步驟的繁瑣

 

這個流程圖中,還是省略了一些步驟,一句話帶過的倍比稀釋,做過的小伙伴們知道,這個說起來容易做起來難。

 

另外在接收菌種和從冷凍保藏管中取出菌種來使用時,還需要進行相應(yīng)的鑒定,所以不要覺得這個流程好冗長,其實已經(jīng)是簡單版的。

編輯:songjiajie2010

 
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