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流動(dòng)相的緩沖溶液如何配?這些細(xì)節(jié)你可能還不知道

放大字體  縮小字體 發(fā)布日期:2022-06-20
核心提示:在制備液相流動(dòng)相時(shí),最讓人頭疼的一件事莫過(guò)于配緩沖鹽和調(diào)pH了,但是這確實(shí)準(zhǔn)確配制流動(dòng)相的關(guān)鍵,今天就和大家一起看看準(zhǔn)確配

在制備液相流動(dòng)相時(shí),最讓人頭疼的一件事莫過(guò)于配緩沖鹽和調(diào)pH了,但是這確實(shí)準(zhǔn)確配制流動(dòng)相的關(guān)鍵,今天就和大家一起看看準(zhǔn)確配備流動(dòng)相的緩沖溶液的原則和需要注意的事項(xiàng)。

緩沖溶液是指由弱酸及其共軛堿(或弱堿及其共軛酸)所組成的緩沖對(duì)配制的,且能夠在加入少量強(qiáng)酸或強(qiáng)堿時(shí),可以有效減緩pH值改變的水溶液。緩沖溶液能幫助維持分析方法的穩(wěn)定,而不會(huì)因?yàn)槲⑷醯沫h(huán)境改變的情況下而造成分析結(jié)果的改變。

緩沖溶液是被用來(lái)維持pH值的穩(wěn)定。它們是通過(guò)維持弱酸及其共軛堿的平衡從而防止了pH值的改變。

緩沖溶液是如何工作的?

根據(jù)Le Chatelier原理,當(dāng)一些強(qiáng)酸 (或者更多的氫離子“H+”) 加入到弱酸及其共軛堿的平衡混合物中時(shí),平衡會(huì)被向左移動(dòng)。同樣,如果在混合物中加入強(qiáng)堿,氫離子濃度下降的幅度會(huì)小于所預(yù)期加入堿的量。

當(dāng)配制緩沖溶液時(shí)

你應(yīng)該遵循以下幾個(gè)原則


在配制緩沖液前,建議用定值校準(zhǔn)緩沖液標(biāo)準(zhǔn)品來(lái)校對(duì)電子pH計(jì)
根據(jù)所需緩沖液的濃度,精確地稱出所需緩沖鹽的重量
把所需的緩沖鹽加到已經(jīng)裝有HPLC色譜級(jí)超純水的容量燒瓶中,并充分?jǐn)嚢柚镣耆芙?br /> 使用pH探針或pH計(jì)去測(cè)量溶液的pH值
通過(guò)添加少量的強(qiáng)酸或強(qiáng)堿,將容液的pH值調(diào)整至所需的值
調(diào)整至所需pH值后,將溶液用色譜級(jí)超純水稀釋至最終的所需體積容量,并混合均勻
HPLC緩沖液通常用于控制在液相色譜分析中所不希望出現(xiàn)的二次相互作用。此外,緩沖液也被用來(lái)工作分析物的電離狀態(tài),以確保分析物不會(huì)同時(shí)出現(xiàn)一個(gè)以上的電離狀態(tài)。

化合物的pKa值代表此化合物的50%離子化和50%中性時(shí)的pH值。如果在此pH值下分析此化合物,你會(huì)看到分裂峰的出現(xiàn)或者不穩(wěn)定的保留時(shí)間。因此,我們建議所有的分析方法的pH值都應(yīng)該控制在目標(biāo)分析化合物的pKa值正負(fù)兩個(gè)pH單位以上。

當(dāng)配制等度流動(dòng)相的時(shí)候,我們

還需要考慮以下幾個(gè)因素來(lái)確保方法的穩(wěn)定

盡可能提前預(yù)混合你所使用的流動(dòng)相,因?yàn)檫@將防止經(jīng)過(guò)泵混合流動(dòng)相時(shí)會(huì)出現(xiàn)的錯(cuò)誤
每一次都需要始終使用相同的配制方法及流程。例如,如果你方法是先加水,那你每次都必須是先加水。如果你是先測(cè)定單獨(dú)的成分然后再混合,那你就必須每次都按這個(gè)流程來(lái)做。記得千萬(wàn)不要改變這一個(gè)固定的配制流程,因?yàn)檫@個(gè)配制流程的改變讓分析物的保留時(shí)間可能出現(xiàn)很大的改變


以下的這個(gè)實(shí)驗(yàn)例子展示了當(dāng)流動(dòng)相

用以下不同的方式來(lái)混合時(shí),

峰保留時(shí)間可能出現(xiàn)的改變

方法一

先加水:先用量筒量400毫升的水并倒進(jìn)1升的容量瓶中,然后用甲醇稀釋至容量瓶的刻度

方法二

先加甲醇:先用量筒量600毫升的甲醇并倒進(jìn)1升的容量瓶中,然后用水稀釋至容量瓶的刻度

方法三

甲醇和水各自先量好:先用量筒量600毫升的甲醇并倒進(jìn)流動(dòng)相瓶中,然后用同樣的量筒量400毫升的水并倒進(jìn)已經(jīng)裝有甲醇的流動(dòng)相瓶中

方法四

讓液相的泵來(lái)混合A瓶中的水和B瓶中的甲醇

緩沖液的濃度也是很重要的。我們一般認(rèn)為,10mM以下的濃度不足夠提供可以控制化合物硅醇活性或者電離狀態(tài)所需要的緩沖能力,因此10mM是反相或者HILIC色譜模式下的最低有效濃度。對(duì)于其他色譜模式,如體積排阻色譜就需要更高的緩沖液濃度,使用超過(guò)100mM濃度的緩沖液在體積排阻色譜法中并不罕見(jiàn)。

緩沖液的濃度必須非常精確地平衡好,以確保在所有的條件下都能達(dá)到完全溶解。在反相條件下,如果方法條件是包含了高比例有機(jī)相的話(例如跨度很大的梯度),則很有可能需要控制緩沖液的濃度,以確保不會(huì)出現(xiàn)緩沖鹽的析出。

當(dāng)開(kāi)發(fā)一個(gè)可靠穩(wěn)定的HPLC方法時(shí),流動(dòng)相的貢獻(xiàn)跟色譜柱固定相的選擇性一樣重要,另外流動(dòng)相的選擇與配制跟色譜柱固定相批次間的質(zhì)檢也是一樣重要的。
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編輯:songjiajie2010

 
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