20世紀(jì)60年代以來，人們逐漸發(fā)現(xiàn)多糖具有復(fù)雜多樣的生物活性和功能，如多糖有免疫調(diào)節(jié)功能可作為廣譜免疫促進(jìn)劑，作為藥物可以治療風(fēng)濕病、慢性病毒性肝炎、癌癥等；還具有抗感染、抗放射、抗凝血、降血糖、降血脂，促進(jìn)核酸與蛋白質(zhì)的生物合成等作用。菱，別名菱角、水菱角、風(fēng)菱，為菱科菱屬植物烏菱TrapabicomisOsbeck的種子，據(jù)文獻(xiàn)記載，其果殼、果柄、果、莖及葉柄均可進(jìn)藥，有健胃止痢、抗癌等作用；還可用于治療胃潰瘍、痢疾、食道癌、子宮頸癌及乳腺癌等。

 

本研究首次從野生菱角殼中提取分離出多糖，并對多糖的單糖組成進(jìn)行了深進(jìn)的研究，為進(jìn)一步開發(fā)和利用野生菱角資源提供了科學(xué)依據(jù)。

 

2、實驗部分
 

2.1 樣品、試劑與儀器市售的菱角往仁后，殼曬干，粉碎備用。單糖及雙糖標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(半乳糖、阿拉伯糖、木糖、鼠李糖、甘露糖、葡萄糖、乳糖和蜜二糖)均購自ChemService，純度大于98％。所用化學(xué)試劑除甲醇和乙醇為色譜純外，其余均為分析純。UV-2501PC紫外光譜儀(日本島津公司)；NicoletMagna560傅里葉變換紅外光譜儀(美國尼高力公司)；VarianUnityPlus600核磁共振波譜儀(美國瓦里安公司)；HP6890和HP5973氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(美國安捷倫公司)。

 

2.2 實驗方法

(1)多糖化合物的提取及純化方法稱取800g洗凈曬干的菱角殼，加人1:1乙醇-乙醚混合液，65℃水浴回流1～3h往脂；殘渣中加水，9O～100℃水浴提取4～6h，更換凈水反復(fù)提取2～3次，合并深紅色多糖提取液，過濾，濃縮。向提取液加人3／7倍體積的乙醇，離心分離沉淀，凍干得多糖粗品F1。向上清液中加人1.0倍體積的乙醇，離心分離沉淀，凍干得多糖粗品F2。依此方法，向上清液中先后加人1.5和4.0倍體積乙醇，分別得到多糖粗品F3和F4。。若直接向原多糖提取液中加人4倍體積的無水乙醇，則得到混合多糖粗品F5。用Sevag法除往多糖粗品中的蛋白質(zhì)，H2O2法除往色素，透析72h后，濃縮，凍干，即得多糖純品；

(2)多糖的水解取多糖樣品10mg于安瓶中加人3moL／L三氟乙酸2mL，密封后在120℃恒溫中水解6h，用氮氣吹干三氟乙酸，加甲醇并吹干，水解產(chǎn)物加進(jìn)0.6mL0.05mol／LNaOH溶液，再加5mgNaBH4，室溫下反應(yīng)8—10h，加少許乙酸分解過量的NaBH4，至無氣泡產(chǎn)生為止。蒸干反應(yīng)液，以酸性甲醇洗滌反應(yīng)產(chǎn)物，蒸干甲醇液，重復(fù)3—4次以除往硼酸根，最后加進(jìn)甲醇蒸干并于烘箱中105℃除凈水分；

(3)乙酰化衍生法取水解得的單糖3mg，加進(jìn)0.5mL吡啶，1mL乙酸酐，加熱2h，冷卻后加甲苯2mL，用N2吹干，加進(jìn)氯仿，蒸餾水洗滌，用N2吹干得到棕黃色產(chǎn)物。此乙�；�的單糖醇用CHC13稀釋后進(jìn)行氣相色譜-質(zhì)譜分析；(4)三甲基硅烷化衍生法取水解得的單糖樣品6mg，加吡啶0.6mL，六甲基四硅胺烷0.2mL，三甲基氯硅烷0.2mL，振蕩，靜置，取上清液進(jìn)行氣相色譜-質(zhì)譜分析。

 

2.3 GC-MS分析條件HP-5石英毛細(xì)管色譜柱(美國安捷倫公司)，(50m×0.22mmi。d。，0.25μm)；EI源，電子能量70eV，分子量掃描范圍33—550，進(jìn)樣口溫度260℃，接口溫度270℃，載氣氦氣流速1.2mL／min，分流比20：1，                                                                     程序升溫：100℃→1O℃／min150℃→15℃/min260℃(40min).

3、結(jié)果與討論

3.1 菱角殼提取物中多糖的鑒定分析Molisch實驗：硫酸和多糖溶液分為兩層，層與層之間有紫色環(huán)出現(xiàn)。說明提取物確含糖�；旌隙嗵荈5純品的FT-IR譜圖。譜圖中多處可見到多糖的特征峰，如：3435/cm，2924/cm的吸收峰分別為O—H，C—H的伸縮振動峰，1193/cm，1037/cm處的吸收峰是多糖中C—O，C—O—C伸縮振動和C—OH的彎曲振動特征峰，在1000—700/cm的吸收峰則是α-和β-吡喃單糖形成的特征。

 

混合多糖F5純品的HNMR譜圖。譜圖中δ3.5—δ5.5之間可見多個糖質(zhì)子的響應(yīng)信號峰，其中δ4.605、δ4.7和δ4.9223個峰是β-吡喃環(huán)上的質(zhì)子信號，而δ5.238、δ5.348、δ5.446、δ5.465和δ5.515則可能來自于α-吡喃環(huán)上的質(zhì)子，由此可見，此多糖可能是由多種單糖組成。

 

3.2 菱角殼多糖中單糖組成的確定樣品F1一F4水解產(chǎn)物的乙�；�衍生物經(jīng)氣相色譜-質(zhì)譜分析，通過與標(biāo)準(zhǔn)色譜圖對照比較和質(zhì)譜碎片解析，確定了其單糖組成及摩爾比。數(shù)據(jù)表明，4種多糖分別由不同摩爾比的幾種單糖(如阿拉伯糖、鼠李糖、木糖、甘露糖、半乳糖、葡萄糖)和二糖(乳糖、蜜二糖)組成，其中多糖F2一F4的單糖組成相同，只是摩爾比略有不同；而F1則由5種單糖和2種二糖組成。葡萄糖，半乳糖和甘露糖在4種多糖中占的比例較大，是菱角多糖的主要成分。

 

混合多糖樣品F5的甲基硅烷化衍生物的GC-MS，經(jīng)碎片分析并利用標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜NIST庫進(jìn)行檢索，l1個色譜峰被確以為單糖的甲基硅烷化衍生物。由于在衍生化過程中α型和β型吡喃和呋喃異構(gòu)體的天生，同一單糖可以天生幾種衍生物。因此，只檢出5種單糖，其中包括兩種戊糖(阿拉伯糖和木糖)，3種己糖(甘露糖，半乳糖和葡萄糖)。從峰面積百分比數(shù)據(jù)還可以看出，葡萄糖、半乳糖、木糖和甘露糖在該混合多糖中所占的比例較大，是菱角多糖的主要成分，這與乙�；�分析的結(jié)果基本一致。