本文探討了口服酵母多糖對(duì)異育銀鯽體內(nèi)免疫相關(guān)物質(zhì)活性與人工感染“鰓出血”病原抗病力的影響,試驗(yàn)結(jié)果證明酵母多糖可提高供試異育銀鯽體內(nèi)免疫相關(guān)物質(zhì)的活性,也可增強(qiáng)異育銀鯽抵抗“鰓出血”病原感染的能力,對(duì)魚類的生長(zhǎng)、體色等無不良影響。本試驗(yàn)由江蘇省水產(chǎn)三新工程項(xiàng)目(編號(hào):D
數(shù)十年來,利用各種抗生素類藥物或者化學(xué)藥物防控養(yǎng)殖魚類的傳染性疾病是常用的措施。但是,藥物引起的病原菌耐藥性和養(yǎng)殖水體中微生態(tài)環(huán)境失衡等問題,已經(jīng)逐漸成為水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中日益嚴(yán)峻的問題。為了避免采用藥物防治養(yǎng)殖魚類的傳染性疾病引起的各種問題,國(guó)內(nèi)、外的研究者在利用免疫刺激劑預(yù)防養(yǎng)殖魚類傳染性疾病方面,也已經(jīng)做了不少研究工作。目前,在國(guó)外已經(jīng)有不少種類的免疫刺激劑正在水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中應(yīng)用。
本研究利用安琪酵母股份有限公司生產(chǎn)的酵母多糖投喂異育銀鯽(Carassius auratus gibelio)后,檢測(cè)了供試異育銀鯽體內(nèi)免疫相關(guān)物質(zhì)活性的變化與抵抗人工感染“鰓出血”病原的能力。
1材料與方法
1、供試異育銀鯽與飼養(yǎng)條件試驗(yàn)在鹽城裕達(dá)水產(chǎn)養(yǎng)殖場(chǎng)池塘中設(shè)置的網(wǎng)箱中進(jìn)行。將來源相同、活潑無外傷的體重為(113.5±5.5)g的異育銀鯽,仔細(xì)挑選規(guī)格相近的放在同一個(gè)網(wǎng)箱中飼養(yǎng)。在同一個(gè)池塘中放置的30個(gè)條件相同網(wǎng)箱中選擇的7個(gè)網(wǎng)箱(分別作為Ⅰ-Ⅶ組),每個(gè)4.0m×4.0m×1.5m的網(wǎng)箱內(nèi)飼養(yǎng)500尾異育銀鯽(圖1),在試驗(yàn)期間溫度變化在17.5-25.5℃之間。每天上午8:00、中午13:00和下午16:30各投喂餌料1次,投餌量以使異育銀鯽達(dá)到飽足并有少量剩余為準(zhǔn)。所用飼料為惠裕飼料科技有限公司生產(chǎn)的異育銀鯽專用飼料。
2、酵母多糖用于本研究的免疫增強(qiáng)劑是安琪酵母股份有限公司以醫(yī)藥專用酵母生產(chǎn)的福邦牌酵母多糖,該產(chǎn)品中含有的β-葡聚糖≥20%,α-甘露聚糖肽≥20%,肽類及蛋白質(zhì)≥30%,幾丁質(zhì)≥2.0%。
3、酵母多糖投喂劑量與程序根據(jù)各組試驗(yàn)異育銀鯽的總體重,在定量的飼料中添加不同劑量的酵母多糖,制作成內(nèi)含不同水平的酵母多糖的顆粒飼料后分別投喂Ⅰ-Ⅵ組試驗(yàn)異育銀鯽,即自I號(hào)至Ⅴ號(hào)網(wǎng)箱的投喂免疫增強(qiáng)劑的劑量分別為100 mg/kg.B.W、200.0 mg/kg.B.W、300.0 mg/kg.B.W、400.0 mg/kg.B.W、500.0 mg/kg.B.W和600.0 mg/kg.B.W。Ⅶ號(hào)網(wǎng)箱的試驗(yàn)異育銀鯽則投喂未添加酵母多糖的飼料,作為對(duì)照組。每天投喂相當(dāng)于魚體重2.5%的飼料,連續(xù)投喂28d。
4、采血于免疫接種并投喂添加酵母多糖飼料后的第29d,從各組中分別隨機(jī)撈取15尾供試異育銀鯽,對(duì)其斷頭取血。將每尾魚的血液分為2份,其中1份以肝素抗凝,制備抗凝血,供檢測(cè)白細(xì)胞吞噬活性;將另一份血液首先在室溫下靜置1 h待其凝固,置4℃冰箱保持4 h后,于4℃條件下以4000 r/min離心10 min,收集上層血清,保存在4℃冰箱中,備用。
5、在0.2 mL抗凝血中加入0.1 mL 福爾馬林滅活的金黃色葡萄球菌,搖勻,在25℃的恒溫水浴鍋中孵育45 min,每隔10 min搖動(dòng)1次。用吸管吸取血細(xì)胞涂片,每個(gè)樣品涂5張,用甲醇固定10 min,Giemsa染色液染1 h,水洗風(fēng)干后,鏡檢,并依下式計(jì)算白細(xì)胞吞噬百分比(phagocytic percentage,PP)和吞噬指數(shù)(phagocytic index,PI)。
吞噬百分比(PP) =(100個(gè)吞噬細(xì)胞中參與吞噬的細(xì)胞數(shù)/100)×100
吞噬指數(shù)(PI )= 細(xì)胞內(nèi)總菌數(shù)/參與吞噬的細(xì)胞數(shù)
6、溶菌酶活性的測(cè)定用0.067mol/L的磷酸緩沖液(PBS,pH 6.4)將溶壁微球菌(Micrococcus lysoleikticus)配制成0.2 mg/mL 的菌懸液。每個(gè)樣品取3.0 mL菌懸液,吸取血清0.04 mL加入到菌懸液中,混勻后,立刻在540 nm下測(cè)定A。值。然后在28℃水浴中溫育30 min,取出后置于4℃冰浴終止反應(yīng),再測(cè)定A值。計(jì)算溶菌酶活性單位:U = (A。- A)/ A 。
7、血清中谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性的測(cè)定采用谷丙轉(zhuǎn)氨酶試劑盒(上海科欣生物技術(shù)研究所產(chǎn)品,批號(hào):20140706)測(cè)定。
8、血清中總蛋白含量的測(cè)定采用血清總蛋白試劑盒(上?菩郎锛夹g(shù)研究所產(chǎn)品,批號(hào):20140711)測(cè)定。
9、攻毒從試驗(yàn)和對(duì)照組網(wǎng)箱中隨機(jī)各撈取50尾供試異育銀鯽,放養(yǎng)在盛水2.0M3的圓形塑料水族箱中充氣飼養(yǎng)。在每個(gè)水族箱中放置5尾體重300.0g左右的具有“鰓出血”典型癥狀的病魚,與50尾供試魚同居飼養(yǎng)2d后將其撈出,將供試魚繼續(xù)飼養(yǎng)觀察21d。對(duì)在此期間死亡的異育銀鯽進(jìn)行解剖觀察,判斷是否由于感染“鰓出血”疾病而致死,統(tǒng)計(jì)各組的死亡率,依下式計(jì)算相對(duì)免疫保護(hù)率(Relative percent survival,RPS)。
免疫保護(hù)率(RPS)= [1-(免疫組死亡率/對(duì)照組死亡率)]×1002
結(jié)果
1、溶菌酶活性和白細(xì)胞吞噬活性的變化投喂添加酵母多糖的飼料后,對(duì)照和試驗(yàn)組異育銀鯽的血清溶菌酶活性和白細(xì)胞吞噬活性的測(cè)定結(jié)果。投喂酵母多糖的試驗(yàn)組異育銀鯽的血清溶菌酶活性顯著高于對(duì)照組(t測(cè)驗(yàn),P<0.05)。白細(xì)胞吞噬活性的測(cè)定結(jié)果表明,試驗(yàn)魚體白細(xì)胞的PP和PI均極顯著地高于對(duì)照組(t測(cè)驗(yàn),P<0.01)。
2、血清總蛋白和SGPT活性的變化供試異育銀鯽的血清中總蛋白含量和SGPT活性測(cè)定結(jié)果。添加免疫多糖的試驗(yàn)組魚體的血清中總蛋白含量有所提高,但是,對(duì)照與試驗(yàn)組異育銀鯽血清中蛋白含量并未出現(xiàn)顯著性差別(t測(cè)驗(yàn),P>0.05)。對(duì)SGPT活性的測(cè)定結(jié)果表明,在飼料中添加酵母多糖可以降低魚體血清中SGPT的活性,但是,試驗(yàn)與對(duì)照組異育銀鯽之間也并未出現(xiàn)顯著性差異(t測(cè)驗(yàn),P>0.05)。
3、攻毒后的存活率 對(duì)照及試驗(yàn)魚在與典型病魚同居感染攻毒后,各組的死亡情況可以看出,經(jīng)過投喂酵母多糖的異育銀鯽均獲得了一定的RPS,而在飼料中添加酵母多糖的試驗(yàn)組異育銀鯽死亡率明顯的低于未添加酵母多糖的對(duì)照組,與對(duì)照組相比,當(dāng)酵母多糖酵在飼料中的添加量為500.0 mg/kg.B.W.時(shí),受免異育銀鯽的獲得了最高的RPS,但是,各個(gè)添加酵母多糖的試驗(yàn)組之間的RPS則未出現(xiàn)顯著性差別(t測(cè)驗(yàn),P>0.05)。
討論
關(guān)于異育銀鯽的“鰓出血”病,研究者們已經(jīng)用不同的方法證明了其病原是病毒。而對(duì)于魚類的病毒性疾病,目前尚無有效的藥物可以治療。本試驗(yàn)結(jié)果證明了酵母多糖對(duì)這種病毒病是具有預(yù)防作用的。本研究結(jié)果不僅證明了酵母多糖對(duì)供試異育銀鯽的幾種免疫相關(guān)物質(zhì)的活性具有刺激作用,而且采用將供試魚與典型病魚同居感染的方式,證明了供試魚是具有提高試驗(yàn)魚抵抗病原感染的作用的。
6個(gè)不同劑量對(duì)供試異育銀鯽血清中幾種免疫相關(guān)物質(zhì)活性的差別均不是很明顯,說明在異育銀鯽的餌料中酵母多糖的添加量以100.0-600.0 mg/kg.B.W.均具有一定的作用。
至于添加有酵母多糖餌料的投喂時(shí)間究竟以連續(xù)多長(zhǎng)時(shí)間為宜,以及在飼料中酵母多糖的最適宜添加量等,尚需要進(jìn)一步研究。
文/譯:華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 陳昌福 胡明