細胞培養(yǎng)的一般過程

一、準備工作
準備工作對開展細胞培養(yǎng)異常重要，工作量也較大，應(yīng)給予足夠的重視，推備工作中某一環(huán)節(jié)的疏忽可導(dǎo)致實驗失敗或無法進行。準備工作的內(nèi)容包括器皿的清洗、干燥與消毒，培養(yǎng)基與其他試劑的配制、分裝及滅菌，無菌室或超凈臺的清潔與消毒，培養(yǎng)箱及其他儀器的檢查與調(diào)試，具體內(nèi)容可參閱有關(guān)文獻。
二、取材
在無菌環(huán)境下從機體取出某種組織細胞（視實驗?zāi)康亩�定），�?jīng)過一定的處理（如消化分散細胞、分離等）后接入培養(yǎng)器血中，這一過程稱為取材。如是細胞株的擴大培養(yǎng)則無取材這一過程。機體取出的組織細胞的首次培養(yǎng)稱為原代培養(yǎng)。
理論上講各種動物和人體內(nèi)的所有組織都可以用于培養(yǎng)，實際上幼體組織（尤其是胚胎組織）比成年個體的組織容易培養(yǎng)，分化程度低的組織比分化高的容易培養(yǎng)，腫瘤組織比正常組織容易培養(yǎng)。取材后應(yīng)立即處理，盡快培養(yǎng)，因故不能馬上培養(yǎng)時，可將組織塊切成黃豆般大的小塊，置4℃的培養(yǎng)液中保存。取組織時應(yīng)嚴格保持無菌，同時也要避免接觸其他的有害物質(zhì)。取病理組織和皮膚及消化道上皮細胞時容易帶菌，為減少污染可用抗菌素處理。
由組織并分離分散細胞的方法可參閱有關(guān)文獻。
三、培養(yǎng)
將取得的組織細胞接入培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)板中的過程稱為培養(yǎng)。如系組織塊培養(yǎng)，則直接將組織塊接入培養(yǎng)器皿底部，幾個小時后組織塊可貼牢在底部，再加入培養(yǎng)基。如系細胞培養(yǎng)，一般應(yīng)在接入培養(yǎng)器皿之前進行細胞計數(shù)，按要求以一定的量（以每毫升細胞數(shù)表示）接入培養(yǎng)器皿并直接加入培養(yǎng)基。細胞進入培養(yǎng)器皿后，立即放入培養(yǎng)箱中，使細胞盡早進入生長狀態(tài)。
正在培養(yǎng)中的細胞應(yīng)每隔一定時間觀察一次，觀察的內(nèi)容包括細胞是否生長良好，形態(tài)是否正常，有無污染，培養(yǎng)基的PH是否太酸或太堿（由酚紅指示劑指示），此外對培養(yǎng)溫度和CO2濃度也要定時檢查。
一般原代培養(yǎng)進入培養(yǎng)后有一段潛伏期（數(shù)小時到數(shù)十天不等），在潛伏期細胞一般不分裂，但可貼壁和游走。過了潛伏期后細胞進入旺盛的分裂生長期。細胞長滿瓶底后要進行傳代培養(yǎng)，將一瓶中的細胞消化懸浮后分至兩到三瓶繼續(xù)培養(yǎng)。每傳代一次稱為“一代”。二倍體細胞一般只能傳幾十代，而轉(zhuǎn)化細胞系或細胞株則可無限地傳代下去。轉(zhuǎn)化細胞可能具有惡性性質(zhì)，也可能僅有不死性（Immortality）而無惡性。
培養(yǎng)正在生長中的細胞是進行各種生物醫(yī)學(xué)實驗的良好材料。
四、凍存及復(fù)蘇
為了保存細胞，特別是不易獲得的突變型細胞或細胞株，要將細胞凍存。凍存的溫度一般用液氮的溫度—－196℃，將細胞收集至凍存管中加入含保護劑（一般為二甲亞砜或甘油）的培養(yǎng)基，以一定的冷卻速度凍存，最終保存于液氮中。在極低的溫度下，細胞保存的時間幾乎是無限的。
復(fù)蘇一般采用快融方法，即從液氮中取出凍存管后，立即放入37℃水中，使之在一分鐘內(nèi)迅速融解。然后將細胞轉(zhuǎn)入培養(yǎng)器皿中進行培養(yǎng)。
凍存過程中保護劑的選用、細胞密度、降溫速度及復(fù)蘇時溫度、融化速度等都對細胞活力有影響。

培養(yǎng)細胞的細胞生物學(xué)

一、體內(nèi)、外細胞的差異和分化
1、差異：細胞離體后，失去了神經(jīng)體液的調(diào)節(jié)和細胞間的相互影響，生活在缺乏動態(tài)平衡的相對穩(wěn)定環(huán)境中，日久天長，易發(fā)生如下變化：分化現(xiàn)象減弱；形態(tài)功能趨于單一化或生存一定時間后衰退死亡；或發(fā)生轉(zhuǎn)化獲得不死性，變成可無限生長的連續(xù)細胞系或惡性細胞系。因此，培養(yǎng)中的細胞可視為一種在特定的條件下的細胞群體，它們既保持著與體內(nèi)細胞相同的基本結(jié)構(gòu)和功能，也有一些不同于體內(nèi)細胞的性狀。實際上從細胞一旦被置于體外培養(yǎng)后，這種差異就開始發(fā)生了。
雖然體外細胞與機體細胞存有差異，但并未失去研究的意義。且不論其有許多性狀仍與體內(nèi)相同（如體外培養(yǎng)的心肌細胞仍可博動），只從細胞遺傳學(xué)（Cyto－genetics）的角度看，離體細胞仍帶有全套的二倍體基因。細胞在培養(yǎng)中的表現(xiàn)，只不過是相應(yīng)基因關(guān)閉／開啟引起的現(xiàn)象，這并非是絕對缺陷。恰恰相反，在培養(yǎng)的細胞中某些特定功能的喪失，可為該基因的表達與調(diào)控提供線索。
2、分化；體外培養(yǎng)的細胞分化能力并未完全喪失，只是環(huán)境的政變，細胞分化的表現(xiàn)和在體內(nèi)不同。細胞是否表現(xiàn)分化關(guān)鍵在于是否存在使細胞分化的條件，如Friend細胞（小鼠紅白血病細胞）在一定的因素作用下可以合成血紅蛋白，血管內(nèi)皮細胞在類似基膜物質(zhì)底物上培養(yǎng)時能長成血管狀結(jié)構(gòu)，雜交瘤細胞能產(chǎn)生特異的單克隆抗體，這些均屬于細胞分化行為。
二、體外培養(yǎng)細胞的分型
（一）貼附型：大多數(shù)培養(yǎng)細胞貼附生長，屬于貼壁依賴性細胞，判斷細胞形態(tài)時不能接體內(nèi)組織學(xué)標(biāo)推判定，僅大致分成以下四型：
1、成纖維細胞型：胞體呈梭型或不規(guī)則三角形，中央有卵圓形核，胞質(zhì)突起，生長時呈放射狀。除真正的成纖維細胞外，凡由中胚層間充質(zhì)起源的組織，如心肌、平滑肌、成骨細胞、血管內(nèi)皮等常呈本型狀態(tài)。另外，凡培養(yǎng)中細胞的形態(tài)與成纖維類似時皆可稱之為成纖維細胞。
2、上皮型細胞：細胞呈扁平不規(guī)則多角形，中央有圓形核，細胞彼此緊密相連成單層膜。生長時呈膜狀移動，處于膜邊緣的細胞總與膜相連，很少單獨行動。起源于內(nèi)、外胚層的細胞如皮膚表皮及其衍生物、消化管上皮、肝胰、肺泡上皮等皆成上皮型形態(tài)。
3、游走細胞型：呈散在生長，一般不連成片，胞質(zhì)常突起，呈活躍游走或變形運動，方向不規(guī)則。此型細胞不穩(wěn)定，有時難以和其他細胞相區(qū)別。
4、多型細胞型：有一些細胞，如神經(jīng)細胞難以確定其規(guī)律和穩(wěn)定的形態(tài)，可統(tǒng)歸于此類。
（二）懸浮型；見于少數(shù)特殊的細胞，如某些類型的癌細胞及白血病細胞。胞體圓形，不貼于支持物上，呈懸浮生長。這類細胞容易大量繁殖。
三、培養(yǎng)細胞的生長和增殖過程
體內(nèi)細胞生長在動態(tài)平衡環(huán)境中，而組織培養(yǎng)細胞的生存環(huán)境是培養(yǎng)瓶、皿或其它容器，生存空間和營養(yǎng)是有限的。當(dāng)細胞增殖達到一定密度后，則需要分離出一部分細胞和更新營養(yǎng)液，否則將影響細胞的繼續(xù)生存，這一過程叫傳代（Passage或Subculture）。每次傳代以后，細胞的生長和增殖過程都會受一定的影響。另外，很多細胞特別是正常細胞，在體外的生存也不是無限的，存在著一個發(fā)展過程。所有這一切，使組織細胞在培養(yǎng)中有著一系列與體內(nèi)不同的生存特點。
（一）培養(yǎng)細胞生命期（Life Span of Culture Cells）
所謂培養(yǎng)細胞生命期，是指細胞在培養(yǎng)中持續(xù)增殖和生長的時間。體內(nèi)組織細胞的生存期與完整機體的死亡衰老基本相一致。組織和細胞在培養(yǎng)中生命期如何？這要看細胞的種類、性狀和原供體的年齡等情況。人胚二倍體成纖維細胞培養(yǎng)，在不凍存和反復(fù)傳代條件下，可傳30～50代，相當(dāng)于150～300個細胞增殖周期，能維待一年左右的生存時間，最后衰老凋亡（Apoptosis）。如供體為成體或衰老個體，則生存時間較短；如培養(yǎng)的為其它細胞如肝細胞或腎細胞，生存時間更短，僅能傳幾代或十幾代。只有當(dāng)細胞發(fā)生遺傳性改變，如獲永生性或惡性轉(zhuǎn)化時，細胞的生存期才可能發(fā)生改變。對此以后將詳述。
正常細胞培養(yǎng)時，不論細胞的種類和供體的年齡如何，在細胞全生存過程中，大致都經(jīng)歷以下三個階段：
1．原代培養(yǎng)（Primary Culture）期：
也稱初代培養(yǎng)，即從體內(nèi)取出組織接種培養(yǎng)到第一次傳代階段，一般持續(xù)1一4周。此期細胞呈活躍的移動，可見細胞分裂，但不旺盛。初代培養(yǎng)細胞與體內(nèi)原組織在形態(tài)結(jié)構(gòu)和功能活動上相似性大。細胞群是異質(zhì)的（Heterogeneous），也即各細胞的遺傳性狀互不相同，細胞相互依存性強。如把這種細胞群稀釋分散成單細胞，在軟瓊脂培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)時，細胞克隆形成率（Cloning Efficiency）很低，即細胞獨立生存性差�？寺⌒纬陕始醇毎�群被稀釋分散成單個細胞進行培養(yǎng)時，形成細胞小群（克�。┑陌俜謹�(shù)。初代培養(yǎng)細胞多呈二倍體核型；由于原代培養(yǎng)細胞和體內(nèi)細胞性狀相似性大，是檢測藥物很好的實驗對象。
2．傳代期：
初代培養(yǎng)細胞一經(jīng)傳代后便改稱做細胞系（Cell Line）。在全生命期中此期的持續(xù)時間最長。在培養(yǎng)條件較好情況下，細胞增殖旺盛，并能維持二倍體核型，呈二倍體核型的細胞稱二倍體細胞系（Diploid Cell Line）。為保持二倍體細胞性質(zhì)，細胞應(yīng)在初代培養(yǎng)期或傳代后早期凍存。當(dāng)前世界上常用細胞均在不出十代內(nèi)凍存。如不凍存，則需反復(fù)傳代以維持細胞的適宜密度，以利于生存。但這樣就有可能導(dǎo)致細胞失掉二倍體性質(zhì)或發(fā)生轉(zhuǎn)化。一般情況下當(dāng)傳代10～50次左右，細胞增殖逐漸緩慢，以至完全停止，細胞進入第三期。
3．衰退期：
此期細胞仍然生存，但增殖很慢或不增殖；細胞形態(tài)輪廓增強，最后衰退凋亡。在細胞生命期階段，少數(shù)情況下，在以上三期任何一點（多發(fā)生在傳代末或衰退期），由于某種因素的影響，細胞可能發(fā)生自發(fā)轉(zhuǎn)化（Spontaneous Transformation）。轉(zhuǎn)化的標(biāo)志之一是細胞可能獲得永生性（Immortality）或惡性性（Malignancy）。細胞永生性也稱不死性，即細胞獲持久性增殖能力，這樣的細胞群體稱無限細胞系（Infinite Cell Line），也稱連續(xù)細胞系（Continuous Cell Line）。在早期文獻中無限細胞系也稱已建立細胞系（Established Cell Line），現(xiàn)已不用。無限細胞系的形成主要發(fā)生在第二期末，或第三期初階段。細胞獲不死性后，核型大多變成異倍體（Heteroploid）。細胞轉(zhuǎn)化亦可用人工方法誘發(fā)，轉(zhuǎn)化后的細胞也可能具有惡性性質(zhì)。細胞永生性和惡性性非同一性狀。
（二）組織培養(yǎng)細胞一代生存期
所有體外培養(yǎng)細胞，包括初代培養(yǎng)及各種細胞系，當(dāng)生長達到一定密度后，都需做傳代處理。傳代的頻率或間隔與培養(yǎng)液的性質(zhì)、接種細胞數(shù)量和細胞增殖速度等有關(guān)。接種細胞數(shù)量大、細胞基數(shù)大、相同增殖速度條件下，細胞數(shù)量增加與飽和速度相對要快（實際上細胞接種數(shù)量大時細胞增殖速度比稀少時要快）。連續(xù)細胞系和腫瘤細胞系比初代培養(yǎng)細胞增殖快，培養(yǎng)液中血清含量多時細胞增殖比少時快。以上情況都會縮短傳代時間。
所謂細胞“一代”一詞，系僅指從細胞接種到分離再培養(yǎng)時的一段時間，這已成為培養(yǎng)工作中的一種習(xí)慣說法，它與細胞倍增一代非同一含義。如某一細胞系為第153代細胞，即指該細胞系已傳代153次。它與細胞世代（Generation）或倍增〔Doubling）不同；在細胞一代中，細胞能倍增3～6次。細胞傳一代后，一般要經(jīng)過以下三個階段：
1．潛伏期（Latent Phase）：
細胞接種培養(yǎng)后，先經(jīng)過一個在培養(yǎng)液中呈懸浮狀態(tài)的懸浮期。此時細胞胞質(zhì)回縮，胞體呈圓球形。接著是細胞附著或貼附于底物表面上，稱貼壁，懸浮期結(jié)束。各種細胞貼附速度不同，這與細胞的種類、培養(yǎng)基成分和底物的理化性質(zhì)等密切相關(guān)。初代培養(yǎng)細胞貼附慢，可長達10～24小時或更多；連續(xù)細胞系和惡性細胞系快，10～30分鐘即可貼附。細胞貼附現(xiàn)象是一個非常復(fù)雜和與多種因素相關(guān)的過程。支持物能影響細胞的貼附；底物表面不潔不利貼附，底物表面帶有陽性電荷利于貼附。另外在貼附過程中，有一些特殊物質(zhì)如纖維連接素（Fibronectin），又稱LETS（Larger External Transformation Substance），細胞表面蛋白（Cell Surface Protein：CSP）等也參與貼附過程。這些物質(zhì)都是蛋白類成分，它們有的存在于細胞膜的表面（如 CSP），有的則來自培養(yǎng)基中的血清（LETS）。近年又從各種不同組織和生物成分中提取出了很多促貼附物質(zhì)。貼附是貼附類細胞生長增殖條件之一。
細胞貼附于支持物后，除先經(jīng)過前述延展過程變成極性細胞，還要經(jīng)過一個潛伏階段，才進入生長和增殖期。細胞處在潛伏期時，可有運動活動，基本無增殖，少見分裂相。細胞潛伏期與細胞接種密度、細胞種類和培養(yǎng)基性質(zhì)等密切相關(guān)。初代培養(yǎng)細胞潛伏期長，約24～96小時或更長，連續(xù)細胞系和腫瘤細胞潛伏期短，僅6～24小時；細胞接種密度大時潛伏期短。當(dāng)細胞分裂相開始出現(xiàn)并逐漸增多時，標(biāo)志細胞已進入指數(shù)增生期。
2．指數(shù)增生期（Logarithmic growth Phase）：
這是細胞增值最旺盛的階段，細胞分裂相增多。指數(shù)增生期細胞分裂相數(shù)量可作為判定細胞生長旺盛與否的一個重要標(biāo)志。一般以細胞分裂（Mitotic Index：MI）表示，即細胞群中每1000個細胞中的分裂相數(shù)。體外培養(yǎng)細胞分裂指數(shù)受細胞種類、培養(yǎng)液成分、pH、培養(yǎng)箱溫度等多種因素的影響。一般細胞的分裂指數(shù)介于0.1%～0.5%，初代細胞分裂指數(shù)低，連續(xù)細胞和腫瘤細胞分裂指數(shù)可高達3%～5%。pH和培養(yǎng)液血清含量變動對細胞分裂指數(shù)有很大影響。指數(shù)增生期是細胞一代中活力最好的時期，因此是進行各種實驗最好的和最主要的階段。在接種細胞數(shù)量適宜情況下，指數(shù)增生期持續(xù)3～5天后，隨細胞數(shù)量不斷增多、生長空間漸趨減少、最后細胞相互接觸匯合成片。細胞相互接觸后，如培養(yǎng)的是正常細胞，由于細胞的相互接觸能抑制細胞的運動，這種現(xiàn)象稱接觸抑制（Contact Inhibition）。而惡性細胞則無接觸抑制現(xiàn)象，因此接觸抑制可作為區(qū)別正常與癌細胞標(biāo)志之一。腫瘤細胞由于無接觸抑制能繼續(xù)移動和增殖，導(dǎo)致細胞向三維空間擴展，使細胞發(fā)生堆積（Piled up）。細胞接觸匯合成片后，雖發(fā)生接觸抑制，只要營養(yǎng)充分，細胞仍然能夠進行增殖分裂，因此細胞數(shù)量仍在增多。但當(dāng)細胞密度進一步增大，培養(yǎng)液中營養(yǎng)成分減少，代謝產(chǎn)物增多時，細胞因營養(yǎng)的枯竭和代謝物的影響，則發(fā)生密度抑制（Density Inhibition），導(dǎo)致細胞分裂停止。因此細胞接觸抑制和密度抑制是兩個不同的概念，不應(yīng)混淆。
3．停滯期（Stagnate Phase）：
細胞數(shù)量達飽和密度后，細胞遂停止增殖，進入停滯期。此時細胞數(shù)量不再增加，故也稱平頂期（Plateau）。停滯期細胞雖不增殖，但仍有代謝活動，繼而培養(yǎng)液中營養(yǎng)漸趨耗盡，代謝產(chǎn)物積累、pH降低。此時需做分離培養(yǎng)即傳代，否則細胞會中毒，發(fā)生形態(tài)改變，重則從底物脫落死亡，故傳代應(yīng)越早越好。傳代過晚（已有中毒跡象）能影響下一代細胞的機能狀態(tài)。在這種情況下，雖進行了傳代，因細胞已受損，需要恢復(fù)，至少還要再傳1～2兩代，通過換液淘汰掉死細胞和使受損輕微的細胞得以恢復(fù)后，才能再用。結(jié)果反而耽誤了時間，這是在實驗中應(yīng)特別注意的。

建立細胞系或細胞株

各種已被命名和經(jīng)過細胞生物學(xué)鑒定的細胞系或細胞株，都是一些形態(tài)比較均一、生長增殖比較穩(wěn)定的和生物性狀清楚的細胞群。因此凡符合上述情況的細胞群也可給以相應(yīng)的名稱，即文獻中常稱之為已鑒定的細胞（Certified Cells）。已鑒定的細胞可用于各種實驗研究和生產(chǎn)生物制品。當(dāng)前世界上已建的各種細胞系（株）已難勝數(shù)，我國也建有百種以上，并在不斷增長中。
一、體外培養(yǎng)細胞的種類和命名
體外培養(yǎng)細胞的名稱，隨培養(yǎng)細胞技術(shù)的發(fā)展和細胞種類的增多而演變。最早采用的名稱為細胞株（Cell strain），以后又出現(xiàn)細胞系（Cell Line）一詞，兩者曾一度混用致概念不明確，導(dǎo)致文獻中也很混亂。我國也曾有類似情況，在我國尚未制定出統(tǒng)一名詞前，本書用的名詞基本參考Schaeffer，W.I.（1979）和國內(nèi)有關(guān)會議、以及國內(nèi)外雜志常用名詞為準。
（一）初代培養(yǎng)
初代培養(yǎng)又稱原代培養(yǎng)，即直接從體內(nèi)取出的細胞、組織和器官進行的第一次的培養(yǎng)物。一旦已進行傳代培養(yǎng)（Subculture）的細胞，便不再稱為初代培養(yǎng)，而改稱為細胞系。
（二）細胞系
初代培養(yǎng)物開始第一次傳代培養(yǎng)后的細胞，即稱之為細胞系。如細胞系的生存期有限，則稱之為有限細胞系（Finite Cell Line）；已獲無限繁殖能力能持續(xù)生存的細胞系，稱連續(xù)細胞系或無限細胞系（Infinite Cell Line）。無限細胞系大多已發(fā)生異倍化，具異倍體核型，有的可能已成為惡性細胞，因此本質(zhì)上已是發(fā)生轉(zhuǎn)化的細胞系。無限細胞系有的只有永生性（或不死性），但仍保留接觸抑制和無異體接種致癌性；有的不僅有永生性，異體接種也有致瘤性，說明已惡性化。這兩種不同性質(zhì)的無限細胞系，在國內(nèi)外文獻中對這些名詞的應(yīng)用上也常不十分嚴格。為概念上的明確，本書中對有惡性的無限細胞系采用“惡性轉(zhuǎn)化細胞系”一詞表示可能更妥。而對那些只具永生性而無惡性的細胞系，則用無限細胞系或轉(zhuǎn)化細胞系即可。當(dāng)前流傳的NIH3T3、Rat-1、10T1/2等均屬這類細胞系。
由某一細胞系分離出來的、在性狀上與原細胞系不同的細胞系，稱該細胞系的亞系（Subline）。
（三）克隆細胞株
從一個經(jīng)過生物學(xué)鑒定的細胞系用單細胞分離培養(yǎng)或通過篩選的方法，由單細胞增殖形成的細胞群，稱細胞株。再由原細胞株進一步分離培養(yǎng)出與原株性狀不同的細胞群，亦可稱之為亞株（Substrain）
（四）二倍體細胞
細胞群染色體數(shù)目具有與原供體二倍細胞染色體數(shù)相同或基本相同（2n細胞占75％或80％以上）的細胞群，稱二倍體細胞培養(yǎng)。如僅數(shù)目相同，而核型不同的即染色體形態(tài)有改變者為假二倍體。二倍體細胞在正常情況下具有限生命期，故屬有限細胞系。但隨供體年齡和組織細胞的不同，二倍體細胞的壽命長短各異。人胚肺成纖維細胞可傳50代土10代，人胚腎只有8～10代，人胚神經(jīng)膠質(zhì)細胞15～30代；如從老齡個體取可傳50則細胞生存期更短。由不同年齡供體取材建立的二倍體細胞系可供研究衰老之用。為保持二倍體細胞能長期被利用，一般在初代或2～5代即大量凍存作為原種（Stook Cells），用時再進行繁殖，用后再繼續(xù)凍存，可供長期使用或延緩細胞的衰老。
（五）遺傳缺陷細胞
從有先天遺傳缺陷者取材（主要為成纖維細胞）培養(yǎng)的細胞，或用人工方法誘發(fā)突變的細胞，都屬遺傳缺欠細胞。這類細胞可能具有二倍體核型，也可呈異倍體。
（六）腫瘤細胞系或株
這是現(xiàn)有細胞系中最多的一類，我國已建細胞系主要為這類細胞。腫瘤細胞系多由癌瘤建成，多呈類上皮型細胞，常已傳幾十代或百代以上，并具有不死性和異體接種致瘤性。
對已建成的各種細胞系或細胞株習(xí)慣上都給以名稱；細胞的命名無嚴格統(tǒng)一規(guī)定，大多采用有一定意義縮寫字或代號表示。但不論什么形式，均不宜太長，以便記憶和了解，今別舉以下幾種代表性的細胞名稱供參考：
HeLa：為供體患者的姓名（來源于宮頸癌）
CHO：中國地鼠卵巢細胞（Chinese Hamster Ovary）
宮-743：宮頸癌上皮細胞，1974年3月建立
NIH3T3：美國國立衛(wèi)生研究所（National Institute of Health）建立；每3天傳代，每次接種3×105細胞／毫升。
二、建立細胞系（或株）的要求
關(guān)于什么樣的體外培養(yǎng)細胞群，可被確認為是已被鑒定的細胞（Certified Cells），國際上也尚無統(tǒng)一的規(guī)定，一般依具體情況而定。在只用作初代培養(yǎng)細胞，只要供體性別、年齡等均一，取材部位及組織種類等條件穩(wěn)定，做鑒定的項目無需很多，有幾項能說明細胞的相關(guān)性狀的即可。如能長期保存并可供其它研究室使用，特別是做反復(fù)傳代的細胞，習(xí)慣上有以下一些要求，并在刊物上報道時應(yīng)加以說明。
（－）組織來源
應(yīng)說明細胞供體所屬物種，來自人體，動物或其它；供體的年齡、性別、取材的器官或組織；如系腫瘤組織，應(yīng)說明臨床病理診斷，組織來源，以及病例號等。
（二）細胞生物學(xué)檢測
應(yīng)了解細胞一般和特殊的生物學(xué)性狀，如細胞的一般形態(tài)、特異結(jié)構(gòu)、細胞生長曲線和分裂指數(shù)、倍增時間、接種率；特異性，如為腺細胞有否特殊產(chǎn)物包括分泌蛋白或激素等；如為腫瘤細胞，應(yīng)力求證明細胞確系來源于原腫瘤組織而非其它，并仍保持性性，為此需做軟瓊脂培養(yǎng)、異體動物接種致瘤性和對正常組織浸潤力等實驗。
（三）培養(yǎng)條件和方法
各種細胞都有自己比較適應(yīng)的生存環(huán)境，因此應(yīng)指明使用的培養(yǎng)基、血清種類、用量以及細胞生存的適宜pH等。
三、已建立細胞系或株的鑒定、管理和使用
近些年，當(dāng)一個細胞系或細胞林建成后，我國常通過組織專家開鑒定會的形式予以鑒定，從學(xué)術(shù)角度考慮，此舉實非必要。按國際慣例，只要研究認真負責(zé)地把有關(guān)資料在雜志或刊物上報道，詳細介紹上述各項目即可。
以前因未建立統(tǒng)一的細胞庫時，對已建立的細胞系（株）多由作者單位自行保管，有浪費人力、交流使用不便、細胞易污染和丟失等弊病。我國已初建成小規(guī)模貯存細胞機構(gòu)，待獲進一步發(fā)展，這對我國細胞培養(yǎng)必將有更大促進作用。
國際上美、英和日本等國已建有細胞庫；美國已有美國標(biāo)準細胞庫或細胞銀行（ATCC）和人遺傳突變細胞庫（HGMR）、細胞衰老細胞庫（CAR）等，其中ATCC不僅是美國也世界最大的細胞庫。ATCC下屬有一組協(xié)作實驗室和一個由眾多專家組成的咨詢委員會。ATCC也是美國國立癌癥研究所（NCI）和美國衛(wèi)生研究所中（NIH）的資源庫，尤與NCI有密切的關(guān)系。ATCC也是世界衛(wèi)生組織WHO的國際培養(yǎng)細胞文獻中心。ATCC現(xiàn)液氮凍存有3200個已經(jīng)過鑒定的細胞系（1992），其中包括來自正常人和各種疾病患者的皮膚成纖維細胞系；和來自不同物種的近75個雜交瘤細胞株。ATCC接納來自世界各國已經(jīng)鑒定的細胞予以貯存，同時也向世界各國的研究者或?qū)嶒炇颐赓M提供研究用細胞（做盈利性研究時收費。） ATCC接納入庫細胞時，必須符合其入庫標(biāo)準， ATCC入庫細胞要求檢測項目如下：
培養(yǎng)簡歷：組織來源日期、物種、組織起源、性別、年齡、供體正�；虍惓＝】禒顟B(tài)、細胞已傳代數(shù)等
凍 存 液：培養(yǎng)基和防凍液名稱
細胞活力：融解前后細胞接種存活率和生長特性
培 養(yǎng) 液：培養(yǎng)基種類和名稱（一般要求不含抗生素）、血清來源和含量
細胞形態(tài)：類型，如為上皮或成纖維細胞等，融解后細胞生長特性
核 型：二倍體或多倍體，標(biāo)記染色體的有無
無污染檢測：包括細菌、真菌、支原體、原蟲和病毒等
物種檢測：檢測同工酶，主要為G6PD和LDH，以證明細胞有否交叉污染以及反轉(zhuǎn)錄酶檢測
免疫檢測：一兩種血清學(xué)檢測
細胞建立者：建立者姓名；檢測者姓名
以上為ATCC入庫基本要求，雜交瘤入庫標(biāo)準尚有所不同，詳細情況請參閱ATCC的“Catalogue of Cell Lines and Hybridomas”