本法是以NaIO４先將HRP表面的糖分子氧化成醛基，然后再與Ig上的氨基相結(jié)合，所獲酶標(biāo)記抗體的產(chǎn)率高，將近70％的HRP和Ig結(jié)合，99％的Ig與酶結(jié)合，酶與Ig的活性無(wú)重大損失，是目前最常用的方法。
1. 原理：經(jīng)典的過(guò)碘酸鈉法中需采用二硝基氟苯封閉HRP上殘留的α-和ε氨基基以避免酶分子之間的交聯(lián)。后來(lái)Wilson等改用在低PH下使NaIO４氧化HRP，從而省去了二硝基氟苯封閉HRP步驟。HRP經(jīng)NaIO４氧化后形成的醛化酶可與抗體分子的氨基相連，形成斯夫氏鹼，后者可進(jìn)一步用NaBH４(或乙醇胺)還原生成穩(wěn)定的酶標(biāo)記抗體。
2. 標(biāo)記步驟:
(1) 稱(chēng)取5mgHRP溶解于1ml蒸餾水中。
(2) 于上液中加入0.2ml新配的0.1M NaIO４溶液，室溫下避光攪拌20分鐘。
(3) 將上述溶液裝入透析袋中，對(duì)1mM PH4.4的醋酸鈉緩沖液透析，4℃過(guò)夜。
(4) 加20μl 0.2M PH9.5碳酸鹽緩沖液，使以上醛化桯RP的PH升高到9.0～9.5，然后立即加入10mg IgG(抗體，或SPA5mg)在1ml 0.01M碳酸鹽緩沖液中，室溫避光輕輕攪拌2小時(shí)。
(5) 加0.1ml新配的4mg／ml NaBH４液，混勻，再置4℃2小時(shí)。
(6) 將上述液裝入透析袋中，對(duì)0.15M PH7.4 PBS透析，4℃過(guò)夜。
其余步驟(純化)同戊二醛標(biāo)記步驟的(6)、(7)、(8)。
3. 結(jié)果判定：
除標(biāo)記物IgG量的計(jì)算，略有不同以外，其余均同戊二醛法。
IgG量(mg／ml)＝(OD280nm-OD403nm×0.3)×0.62
4. 試劑及器材:
(1) 0.1M NaIO４：稱(chēng)取241mg高碘酸鈉(廣州化學(xué)試劑廠，批號(hào)830602)溶于蒸餾水10ml中。
(2) 1mM PH4.4醋酸鈉緩沖液:
0.2M NaAc (1.361克／50ml) 3.7ml
0.2M HAc (0.601ml／50ml) 6.3ml
加蒸餾水至2,000ml。
(3) 0.2M PH9.5碳酸鹽緩沖液:
Na２CO３ 0.32克
NaHCO３ 0.586克
加蒸餾水至50ml
再用蒸餾水作20倍稀釋?zhuān)闯?.01M PH9.5的碳酸鹽緩沖液。
(4) NaBH４溶液(4mg／ml):
臨用時(shí)稱(chēng)取NaBH４4mg溶于1ml蒸餾水中。
(5) 其它的試劑及器材可參見(jiàn)戊二醛標(biāo)記法。