先找到需要設(shè)計(jì)引物的目標(biāo)基因的在有引物序列的mRNA序列，可以通過全文（如最先發(fā)現(xiàn)該基因的文章），全文中有時(shí)可以找到大鼠c-jun mRNA序列的ACCESSION NUMBER，在PubMed中的“Nucleotide”中用此ACCESSION NUMBER就能找到序列。可以利用這個(gè)ACCESSION NUMBER在PubMed中的“Nucleotide”中搜索到序列后，點(diǎn)擊右邊的“Links”，再點(diǎn)擊里面的“Related Sequences”就能找到所有的大鼠c-jun mRNA序列及其他物種的一些c-jun mRNA序列。
文獻(xiàn)中的引物最好先驗(yàn)證其序列正確，并用軟件分析引物比較好后再采用。通過BLAST驗(yàn)證，既可知道序列是否正確，也可同時(shí)了解引物的特異性、引物的位置及PCR產(chǎn)物的大小等。
如果僅僅是為了驗(yàn)證引物序列是否正確（僅適合于基于完全匹配原則設(shè)計(jì)的引物），也可以用Blast的“Nucleotide-nucleotide BLAST (blastn)”或“Search for short, nearly exact matches”搜索，具體方法為：
1. 打開Blast，點(diǎn)擊“Nucleotide-nucleotide BLAST (blastn)”或“Search for short, nearly exact matches”
2. 等新頁面完全顯示后，將引物序列直接copy到“Search”框（沒有必要將下游引物序列轉(zhuǎn)換成其互補(bǔ)鏈），下面3種方法都可以（我覺得這3種方法的搜索結(jié)果沒有什么區(qū)別，沒仔細(xì)比較過哦！）
�。ǎ保┲苯涌截惿嫌我镄蛄�，然后直接將下游引物序列拷貝在上游引物后面
（２）直接拷貝上游引物序列，在上游引物序列后加一空格，然后直接將下游引物序列拷貝在空格后面
�。ǎ常┲苯涌截惿嫌我镄蛄�，換行，然后直接拷貝下游引物序列
注意：記住上、下游引物的長度，如上游引物為19bp、下游引物為18bp，這在查看Blast結(jié)果時(shí)有用。
3. 點(diǎn)擊“BLAST！”，新頁面完全出來以后，點(diǎn)擊“Format！”。
4. 結(jié)果完全出來后，查找有沒有和1-19、20-37同時(shí)完全匹配的基因，其他的就不用考慮了。當(dāng)然，如果下游引物序列所對(duì)應(yīng)的基因片段的3'端正好和上游引物序列的3'端的1或2個(gè)堿基互補(bǔ)，那就可能是19-37或18-37。
如果有，那你的引物序列就是正確的。從文獻(xiàn)上查的引物，除了要用Blast驗(yàn)證其序列是否正確外，還是應(yīng)該用軟件分析分析到底引物好不好。
