一、溫度循環(huán)參數(shù)

　　在PCR自動(dòng)熱循環(huán)中，最關(guān)鍵的因素是變性與退火的溫度。如操作范例所示，其變性、退火、延伸的條件是：94℃60s, 37℃60s, 72℃120s，共25～30個(gè)循環(huán)，擴(kuò)增片段500bp。在這里，每一步的時(shí)間應(yīng)從反應(yīng)混合液達(dá)到所要求的溫度后開始計(jì)算。在自動(dòng)熱循環(huán)儀內(nèi)由混合液原溫度變至所要求溫度的時(shí)間需要30～60s，這一遲滯時(shí)間的長(zhǎng)短取決于幾個(gè)因素，包括反應(yīng)管類型、壁厚、反應(yīng)混合液體積、熱源（水浴或加熱塊）以及兩步驟間的溫度差，在設(shè)置熱循環(huán)時(shí)應(yīng)充分給以重視和考慮，對(duì)每一儀器均應(yīng)進(jìn)行實(shí)測(cè)。

　　關(guān)于熱循環(huán)時(shí)間的另一個(gè)重要考慮是兩條引物之間的距離；距離越遠(yuǎn)，合成靶序列全長(zhǎng)所需的時(shí)間也越長(zhǎng)，前文給出的反應(yīng)時(shí)間是按最適于合成長(zhǎng)度500bp的靶序列擬定的。下面就各種溫度的選擇作一介紹。

　　1．模板變性溫度變性溫度是決定PCR反應(yīng)中雙鏈DNA解鏈的溫度，達(dá)不到變性溫度就不會(huì)產(chǎn)生單鏈DNA模板，PCR也就不會(huì)啟動(dòng)。變性溫度低則變性不完全，DNA雙鏈會(huì)很快復(fù)性，因而減少產(chǎn)量。一般取90～95℃。樣品一旦到達(dá)此溫度宜迅速冷卻到退火溫度。DNA變性只需要幾秒種，時(shí)間過久沒有必要；反之，在高溫時(shí)間應(yīng)盡量縮短，以保持Taq DNA聚合酶的活力，加入Taq DNA聚合酶后最高變性溫度不宜超過95℃。

　　2．引物退火溫度退火溫度決定PCR特異性與產(chǎn)量；溫度高特異性強(qiáng)，但過高則引物不能與模板牢固結(jié)合，DNA擴(kuò)增效率下降；溫度低產(chǎn)量高，但過低可造成引物與模板錯(cuò)配，非特異性產(chǎn)物增加。一般先由37℃反應(yīng)條件開始，設(shè)置一系列對(duì)照反應(yīng)，以確定某一特定反應(yīng)的最適退火溫度。也可根據(jù)引物的（G C）%含量進(jìn)行推測(cè)，把握試驗(yàn)的起始點(diǎn)，一般試驗(yàn)中退火溫度Ta(annealing temperature)比擴(kuò)增引物的融解溫度TTm(melting temperature)低5℃，可按公式進(jìn)行計(jì)算：

Ta = Tm - 5℃= 4(G C) 2(A T) -5℃

　　其中A，T，G，C分別表示相應(yīng)堿基的個(gè)數(shù)。例如，20個(gè)堿基的引物，如果（G C）%含量為50%時(shí)，則Ta的起點(diǎn)可設(shè)在55℃。在典型的引物濃度時(shí)（如0.2μmol/L）,退火反應(yīng)數(shù)秒即可完成，長(zhǎng)時(shí)間退火沒有必要。

　　3．引物延伸溫度溫度的選擇取決于Taq DNA聚合酶的最適溫度。一般取70～75℃，在72℃時(shí)酶催化核苷酸的標(biāo)準(zhǔn)速率可達(dá)35～100個(gè)核苷酸/秒。每分鐘可延伸1kb的長(zhǎng)度，其速度取決于緩沖溶液的組成、pH值、鹽濃度與DNA模板的性質(zhì)。擴(kuò)增片段如短于150bp，則可省略延伸這一步，而成為雙溫循環(huán)，因Taq DNA聚合酶在退火溫度下足以完成短序列的合成。對(duì)于100～300bp之間的短序列片段，采用快速、簡(jiǎn)便的雙溫循環(huán)是行之有效的。此時(shí)，引物延伸溫度與退火溫度相同。對(duì)于1kb以上的DNA片段，可根據(jù)片段長(zhǎng)度將延伸時(shí)間控制在1～7min，與此同時(shí)，在PCR緩沖液中需加入明膠或BSA試劑，使Taq DNA聚合酶在長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)保持良好的活性與穩(wěn)定性；15%～20%的甘油有助于擴(kuò)增2.5kb左右或較長(zhǎng)DNA片段。

　　4．循環(huán)次數(shù)常規(guī)PCR一般為25～40個(gè)周期。一般的錯(cuò)誤是循環(huán)次數(shù)過多，非特異性背景嚴(yán)重，復(fù)雜度增加。當(dāng)然循環(huán)反應(yīng)的次數(shù)太少，則產(chǎn)率偏低。所以，在保證產(chǎn)物得率前提下，應(yīng)盡量減少循環(huán)次數(shù)。

　　擴(kuò)增結(jié)束后，樣品冷卻并置4℃保存。

　　二、引物引物設(shè)計(jì)

　　要擴(kuò)增模板DNA，首先要設(shè)計(jì)兩條寡核苷酸引物，所謂引物，實(shí)際上就是兩段與待擴(kuò)增靶DNA序列互補(bǔ)的寡核苷酸片段，兩引物間距離決定擴(kuò)增片段的長(zhǎng)度，兩引物的5’端決定擴(kuò)增產(chǎn)物的兩個(gè)5’末端位置。由此可見，引物是決定PCR擴(kuò)增片段長(zhǎng)度、位置和結(jié)果的關(guān)鍵，引物設(shè)計(jì)也就更為重要。

　　引物設(shè)計(jì)的必要條件是與引物互補(bǔ)的靶DNA序列必須是已知的，兩引物之間的序列未必清楚，這兩段已知序列一般為15～20個(gè)堿基，可以用DNA合成儀合成與其對(duì)應(yīng)互補(bǔ)的二條引物，除此之外，引物設(shè)計(jì)一般遵循的原則包括：

　　1．引物長(zhǎng)度根據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)計(jì)算，長(zhǎng)約17個(gè)堿基的寡核苷酸序列在人的基因組中可能出現(xiàn)的機(jī)率的為1次。因此，引物長(zhǎng)度一般最低不少于16個(gè)核苷酸，而最高不超過30個(gè)核苷酸，最佳長(zhǎng)度為20～24個(gè)核苷酸。這樣短的寡核苷酸在聚合反應(yīng)溫度（通過72℃）下不會(huì)形成穩(wěn)定的雜合體。有時(shí)可在5’端添加不與模板互補(bǔ)的序列，如限制性酶切位點(diǎn)或啟動(dòng)因子等，以完成基因克隆和其他特殊需要；引物5’端生物素標(biāo)記或熒光標(biāo)記可用于微生物檢測(cè)等各種目的。

　　有時(shí)引物不起作用，理由不明，可移動(dòng)位置來解決。

　　2．（G C）%含量引物的組成應(yīng)均勻，盡量避免含有相同的堿基多聚體。兩個(gè)引物中（G C）%含量應(yīng)盡量相似，在已知擴(kuò)增片段（G C）%含量時(shí)宜接近于待擴(kuò)增片段，一般以40%～60%為佳。

　　3．引物內(nèi)部應(yīng)避免內(nèi)部形成明顯的次級(jí)結(jié)構(gòu)，尤其是發(fā)夾結(jié)構(gòu)（hairpin structures）。

　　4．引物之間兩個(gè)引物之間不應(yīng)發(fā)生互補(bǔ)，特別是在引物3’端，即使無法避免，其3’端互補(bǔ)堿基也不應(yīng)大于2個(gè)堿基，否則易生成“引物二聚體”或“引物二倍體”（Primer dimer）。所謂引物二聚體實(shí)質(zhì)上是在DNA聚合酶作用下，一條引物在另一條引物序列上進(jìn)行延伸所形成的與二條引物長(zhǎng)度相近的雙鏈DNA片段，是PCR常見的副產(chǎn)品，有時(shí)甚至成為主要產(chǎn)物。

　　另外，兩條引物之間避免有同源序列，尤為連續(xù)6個(gè)以上相同堿基的寡核苷酸片段，否則兩條引物會(huì)相互競(jìng)爭(zhēng)模板的同一位點(diǎn)；同樣，引物與待擴(kuò)增靶DNA或樣品DNA的其它序列也不能存在6個(gè)以上堿基的同源序列。否則，引物就會(huì)與其它位點(diǎn)結(jié)合，使特異擴(kuò)增減少，非特異擴(kuò)增增加。

　　5．引物3’端配對(duì)DNA聚合酶是在引物3’端添加單核苷酸，所以，引物3’端5～6個(gè)堿基與靶DNA的配對(duì)要求必須精確和嚴(yán)格，這樣才能保證PCR有效擴(kuò)增。

　　引物設(shè)計(jì)是否合理可用PCRDESN軟件和美國(guó)PRIMER軟件進(jìn)行計(jì)算機(jī)檢索來核定。

　　人工合成的寡核苷酸引于最好經(jīng)過色譜（層析）純化或PAGE純化，以除去未能合成至全長(zhǎng)的短鏈等雜質(zhì)。純化引物在25%乙腈溶液中4℃保存可阻止微生物的生長(zhǎng)；一般情況下，不用的引物應(yīng)保存在-20℃冰箱中，在液體中引物能保存6個(gè)月，凍干后可保存1～2年。

　　三、DNA聚合酶

　　早在1956年Kornberg等就從大腸桿菌提取液中發(fā)現(xiàn)了DNA聚合酶，并且得到了DNA聚合酶Ⅰ純品。DNA聚合酶Ⅰ是由分子量為109000的一條多肽鏈構(gòu)成，此酶可被枯草桿菌蛋白酶分解為兩個(gè)片段，一個(gè)片段分子量為76000，有聚合酶活性，并有3’→5外切酶活力，即Klenow片段（Klenow fragment）。另一個(gè)片段分子量為34000，具有5’→’3’外切酶活力。因此，DNA聚合酶具有幾種功能：一是聚合作用，以DNA為模板，將dNTP中的脫氧單核苷酸逐個(gè)加到3-OH末端。二是有’3’→5’外切酶活力，能識(shí)別和消除錯(cuò)配的引物末端，與復(fù)制過程中校正功能有關(guān)。三是5’→3’外切酶活力，它能從5’端水解核苷酸，還能經(jīng)過幾個(gè)核苷酸起作用，切除錯(cuò)配的核苷酸。1985年Mullis 等發(fā)明了PCR方法，以Klenow片段完成β-珠蛋白的PCR后，世界上許多實(shí)驗(yàn)室就考慮用耐熱DNA聚合酶代替Klenow片段進(jìn)行PCR，使耐熱多聚酶的研究得以迅速發(fā)展。人們從生活于60℃（B.Stearothermophilus）到87℃（S.Solfatavicus）的許多菌中分離純化出耐熱DNA聚合酶，但有些酶不能耐受DNA變性所需溫度，所以無法應(yīng)用于PCR。現(xiàn)就PCR反應(yīng)中常用的DNA聚合酶等作一詳細(xì)介紹。

　　1．Taq DNA聚合酶用Taq DNA聚合酶代替大腸桿菌DNA聚合酶Ⅰ的Klenow片段是使PCR普及應(yīng)用的關(guān)鍵。Klenow片段不能耐受95℃的雙鏈DNA變性溫度，所以每次循環(huán)都要加入新酶；而Taq DNA聚合酶可以耐受93～95℃的高溫，避免了不斷補(bǔ)加多聚酶的繁瑣操作，同時(shí)使退火和延伸溫度得以提高，減少了非特異性產(chǎn)物和DNA二級(jí)結(jié)構(gòu)對(duì)PCR的干擾，增進(jìn)了PCR特異性、產(chǎn)量和敏感度，二者相比，其主要區(qū)別在于：①Klenow酶的最適溫度為37℃，擴(kuò)增的產(chǎn)物并非全是目的序列，需用探針檢測(cè)。Taq酶則不僅產(chǎn)率高而特異性也高。它的最適溫度為74～75℃。因而使退火溫度可以提高，使退火嚴(yán)格性提高，減少錯(cuò)配引物的延伸。②循環(huán)后期酶量漸感不足而產(chǎn)生平坡。到達(dá)平玻的循環(huán)次數(shù)，Klenow酶為20個(gè)（均用1μg基因組DNA開始）而Taq酶為30個(gè)。③延伸片段長(zhǎng)度Taq酶為10kb以內(nèi)，而Klenow酶為400bp以內(nèi)。

　　Taq酶由水棲高溫菌（Thermus aquatics）YT1蓖株中分離而得。此菌于1969年由Brock分離自美國(guó)黃石公園溫泉，作為棲熱桿菌的標(biāo)準(zhǔn)菌株，其生長(zhǎng)溫度為70～75℃。最初從中分離到分子量60～68KDa，比活性為2000～8000U/mg的DNA聚合酶。后來Cetus公司的Kary Mullis等又分離到比活為20萬U/mg的純酶，分子量為93910。此種9.4KDa酶的最適溫度為75～80℃，與單純核苷酸的結(jié)合率（Kcat）可達(dá)150核苷酸（nt）/s酶分子。以M13模板，用富含G C的30bp引物延伸，70℃時(shí)Kact>60nt/s；55℃可達(dá)24nt/s；37℃時(shí)為1.5nt/s，而22℃時(shí)低至0.25nt/s。高于90℃時(shí)DNA合成活性甚差，這種高溫條件下，引物與模板已不能牢固結(jié)合。

　　在PCR反應(yīng)混合液中，Taq酶于92.5℃,95℃及97.5℃保持其50%活力的時(shí)間分別為130、40及5～6min，在50次循環(huán)的PCR中當(dāng)管內(nèi)最高溫度為95℃。每循環(huán)為20s時(shí)尚可保持65%活力。Taq 酶在95℃的半壽期為40min，故在PCR循環(huán)中選用的變性溫度，不宜高于95℃。

　　Taq酶現(xiàn)已可用基因重組的方法生產(chǎn)，商品名為Ampli Taq（Cetus公司）。Taq酶的完整基因長(zhǎng)2499bp，在大腸桿菌中表達(dá)生產(chǎn)，含832個(gè)氨基酸。在氨基酸序列上與大腸桿菌DNA聚合酶Ⅰ有38%是一致的，包括對(duì)dNTP結(jié)合，引物與模板作用區(qū)均存在于Taq酶中。

　　Taq酶具有依賴DNA合成的5’→’3’外切酶活性，因此，模板上有一段退火的3’-磷酸化的“阻斷物”，會(huì)被逐個(gè)切除而不會(huì)阻止來自上游引物鏈的延伸，而對(duì)于5’-32P標(biāo)記的合成寡核苷酸引物，則無論是單鏈或是與模板復(fù)性，都未發(fā)現(xiàn)降解，所以該種活性不會(huì)影響PCR結(jié)果。Taq酶沒有3’→’5’外切酶活性，如果發(fā)生dNTP錯(cuò)誤摻入，這種酶沒有校正能力，因此運(yùn)用Taq酶進(jìn)行PCR，產(chǎn)物中點(diǎn)突變較多，對(duì)克隆等不太有利。一般錯(cuò)摻率為1.25×10-4~1×10-5(4×dNTPs濃度分別為200μmol/L，Mg2 為1.5mmol/L，在55℃退火)。但不含3’→5’外切酶活性對(duì)測(cè)序有利。

　　2．影響酶活力的因素Taq酶的活力受Mg2 離子的影響。用鯡精DNA為模板，總dNTP濃度0.7～0.8mmol/L,Mg2 為2.0mmol/L時(shí)激活能力最高。濃度超過此值產(chǎn)生抑制。10mmol/l MgCl2抑制活力達(dá)40%～50%。dNTP能與Mg2 結(jié)合，故游離Mg2 只是結(jié)合后剩余的量。若總dNTP濃度高至4～6mmol/L時(shí),Taq酶活力要降低20～30%，即底物抑制。

　　dNTP濃度低時(shí)PCR產(chǎn)率及特異性均增高，適合于用擴(kuò)增摻入法標(biāo)記生物素及放射性元素。當(dāng)100μl　PCR液中含dNTP各40μmol/L時(shí)就足以合成2.6μg的DNA（dNTP消耗一半）。

　　用鯡精DNA，70℃，10min內(nèi)dNTP的摻入量計(jì)算，標(biāo)準(zhǔn)條件為100%。

　　純9.4KDa Taq酶不含3’→5’核酸外切酶活力。誤摻入率取決于dNTP濃度。但Taq酶具有DNA依賴的鏈移位5’→3’核酸外切酶活力。對(duì)5’→3’32P標(biāo)記寡核苷酸單鏈，或與MB模板雜交時(shí)均只有極少的降解力。

　　中等濃度KCl能刺激Taq酶合成活力達(dá)50%～60%，最佳KCl濃度為50mmol/L，濃度更高有抑制作用，>200mmol/L的KCl可使酶失活。

　　加入50mmol/L NH4Cl或NH4Ac或NaCl,可產(chǎn)生中度抑制或無作用。

　　低濃度尿素、DMSO、DMF或甲酰胺影響不大，吐溫20/NP40可消除SDS（0.01%及0.1%）的抑制作用。

　　3．第二代耐熱DNA聚合酶Stoffel片段：Cetus公司的Stoffel將Taq DNA聚合酶的5’→3’外切酶活性片段（N端289個(gè)氨基酸）去除，稱為stoffel片段。其97.5℃的半衰期從Taq DNA聚合酶的5～6min提高到20min，同時(shí)該酶片段也對(duì)兩個(gè)或更多模板位點(diǎn)的擴(kuò)增反應(yīng)即復(fù)合PCR（Multiplex PCR）更為有利。

　　VentTM DNA多聚酶：是美國(guó)New England Biolabs公司從潛水艇排氣孔（Vent）中分離的超級(jí)嗜熱菌-能生長(zhǎng)于98℃中的Thermococcus litoralis中分離純化得到的，故名Vent酶。它的一些酶學(xué)性質(zhì)較Taq DNA聚合酶更為優(yōu)越，它能耐100℃高溫且2h以上仍有活力，并且具有3’→5’外切酶活性的校正能力，錯(cuò)誤擴(kuò)增的機(jī)率比Taq酶降低一倍。后來該公司又從深水潛艇（2010m）排氣孔分離的能在104℃生長(zhǎng)的Pyococcus菌GB-D株植入Deep Vent DNA聚合酶基因而表達(dá)的Deep Vent DNA聚合酶，在95℃的半壽期達(dá)23h（Vent酶為6.7h,Taq酶為1h）。

　　4．RTth逆轉(zhuǎn)錄酶（rTth Reverse Transcriptase）目前逆轉(zhuǎn)錄-PCR（RT-PCR）的發(fā)展很快，所以對(duì)耐熱的依賴于RNA的DNA多聚酶的研究也有進(jìn)展。有實(shí)驗(yàn)表明Taq DNA多聚酶有依賴于RNA的DNA聚合酶活性，但活性較弱。Cetus公司于1991年推出一種rTth Reverse Tran－scriptase,有很好的依賴于RNA的耐熱DNA聚合酶活性和依賴于DNA的耐熱DNA聚合酶活性，二種活性分別依賴于Mn2 Mg2 ，這樣就可分別控制酶活性。利用該酶只需250ng的總RNA即可有效地進(jìn)行RT-PCR，得到特異的DNA片段，從而非常有利于逆轉(zhuǎn)錄PCR的發(fā)展。

　　耐熱DNA聚合酶的研究近幾年來得到長(zhǎng)足的發(fā)展，這在PCR發(fā)展中起到了重要的作用。我們相信隨著進(jìn)一步的研究，將使人們對(duì)耐熱DNA聚合酶的認(rèn)識(shí)和應(yīng)用更進(jìn)一步地發(fā)展。

　　我國(guó)的PCR研究發(fā)展很快，其關(guān)鍵試劑-耐熱DNA聚合酶-也已有幾個(gè)實(shí)驗(yàn)室能夠分離純化，如復(fù)旦大學(xué)遺傳學(xué)研究所、華美公司、中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所。后二者的菌株為Thermus aquaticus YT-1。前者則是從自己篩選的嗜熱菌中分離純化，復(fù)旦大學(xué)遺傳所亦已成功地克隆了該聚合酶的基因并獲得了耐熱F4DNA聚合酶，其酶學(xué)性質(zhì)非常接近于Taq DNA聚合酶，為我國(guó)PCR的開展提供了保證。

　　四、影響PCR特異性的因素

　　通過上述內(nèi)容。可以看出有許多因素可以影響PCR的特異性，在此我們作一歸納，供大家參考：①退火步驟的嚴(yán)格性：提高退火溫度可以減少不匹配的雜交，從而提高特異性。②減短退火時(shí)間及延伸時(shí)間可以減少錯(cuò)誤引發(fā)及錯(cuò)誤延伸。③引物二聚體是最常見的副產(chǎn)品，降低引物及酶的濃度也可以減少錯(cuò)誤引發(fā)，尤其是引物的二聚化。④改變MgCl2(有時(shí)KCl)濃度可以改進(jìn)特異性，這可能是提高反應(yīng)嚴(yán)格性或者對(duì)Taq酶的直接作用。⑤模板中如果存在次級(jí)結(jié)構(gòu)，例如待擴(kuò)增的片段易自行形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)時(shí)，可在PCR混合物中的4×dNTPs中加入7-脫氮-2’-脫氧鳥苷-5’-三磷酸（7-deaza-2’-deoxyguanosine-5’-trihosphate）(de7GTP)。用de7GTP與dGTP比例為3：1的混合物（150μmol/l de7GTP 50μmol/L dGTP）代替200μmol/l dGTP，則可阻非特異性產(chǎn)物的生成。

　　五、擴(kuò)增平坡

　　擴(kuò)增反應(yīng)并不是可以無窮地進(jìn)行下去的，經(jīng)過一定的循環(huán)周期后需擴(kuò)增的片段不再按指數(shù)增多而逐漸進(jìn)入平坡；進(jìn)入平坡的循環(huán)次數(shù)，取決于起始時(shí)存在的模板拷貝數(shù)以及合成的DNA總量。所謂平坡就是批PCR循環(huán)的后期，合成產(chǎn)物達(dá)0.3～1pmol時(shí)，由于產(chǎn)物的堆積，使原來以指數(shù)增加的速率變成平坦的曲線。

　　造成PCR進(jìn)入平坡的原因有：引物和dNTP等消耗完畢、Taq酶失活，這幾中因素在標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)中均不會(huì)出現(xiàn)。此外，還有幾種可能：

　　1．底物過�！　∫駾NA合成量多于反應(yīng)液中存在的Taq酶，在100μl反應(yīng)液中含2.5Utaq酶而DNA合成量達(dá)1μg（3nmol脫氧核苷酸）時(shí)，開始變?yōu)榈孜镞^剩。延長(zhǎng)延伸時(shí)間或添加Taq酶，可以克服之。但不實(shí)用，因每進(jìn)行下一循環(huán)就要延長(zhǎng)延伸時(shí)間一倍及多加一倍Taq酶，才能繼續(xù)保持指數(shù)增長(zhǎng)。

　　2．非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物的競(jìng)爭(zhēng)　　與上述情況密切相關(guān)，此時(shí)不需要的DNA片段與需要的片段同時(shí)競(jìng)爭(zhēng)聚合酶，要克服這一情況是要提高反應(yīng)特異性，使不需要片段不能大量積聚。

　　3．退火時(shí)產(chǎn)物的單鏈自己締合　　兩條單鏈的DNA片段在退火時(shí)除了與引物締合外，也可以自行締合，這也會(huì)阻止產(chǎn)品增多。當(dāng)產(chǎn)物濃度到達(dá)10pmol/100μl時(shí)即可發(fā)生此現(xiàn)象，除稀釋外無法克服。

　　4．變性在高濃度產(chǎn)物條件下，產(chǎn)物解鏈不完全，以及最終產(chǎn)物的阻化作用（焦磷酸化，雙鏈DNA）。

　　總而言之，PCR的條件是隨系統(tǒng)的而異的，并無統(tǒng)一的最佳條件，先選用通用的條件擴(kuò)增，然后稍稍改變各參數(shù)，可以達(dá)到優(yōu)化，以取得優(yōu)良的特異性和產(chǎn)率。