�。�1）放射性碘源的選用：無載體的131I或125I均可用于碘化標記，但應盡量選用新鮮的、比放射強度高的、含還原劑量少的放射性碘源。碘源的比放射強度最好≥50～100mCi/ml，至少也要>30mCi/ml，否則加入碘源的容量要增加，隨著帶入碘源中含有的還原劑（為放射性碘源運輸保存所需加入）量也增加，這將會顯著降低碘利用率及標記蛋白比放射強度。放置較久和放射性碘源，一方面因衰變致比放射強度降低，另一方面因水的輻射化學產(chǎn)物增多（主要是131I源），都會降低標記時的碘利用率。放射性碘源含還原劑（如Na2S2O5等）量多時，會抵消氯胺T的作用，降低碘利用率，甚至導致標記完全失敗。放射性碘源要用無載體的，標記所用全部用具和試劑必須不含碘；只要有極少量的碘的污染，非放射性碘就會稀釋放射性碘，使放射性碘利用率顯著降低。為了便于放射性防護和除污染，以及減少射線對蛋白質(zhì)分子的損傷，標記投入的放射碘量不宜過大，一般以<5mCi為宜。

　�。�2）放射性碘與多肽、蛋白質(zhì)用量的比例：這比例對標記結(jié)果的影響很大。如上述原因，一般標記時放射性投入量不宜過多，示蹤實驗室中常規(guī)每次只用1～2mCi，因而放射性碘與多肽、蛋白質(zhì)用量的比值主要靠標記時投入的多肽、蛋白質(zhì)用量來控制。當投入的放射碘量一定時，多肽、蛋白質(zhì)用量多（即I/多肽、蛋白質(zhì)比值低），能獲得高碘利用率，但所得標記蛋白比放射強度低；相反多肽、蛋白質(zhì)用量少（即I/多肽、蛋白質(zhì)比值高），則碘利用率降低，但所得標記多肽、蛋白比放射性隨此比值變化都有較大的變動；而當此比值<1后，則碘利用率再下降的幅率較小，標記多肽、蛋白比放射性也不會再增加多少。

　�。�3）氯胺T與偏重亞硫酸鈉的用量及碘化反應時間：氧化碘化標記法中，會導致失活的最主要原因是氧化還原。氯胺T是氧化劑，早期用氯胺T法作碘化標記時氯胺T用量都比較大，或碘化反應時間較長，結(jié)果導致蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和活性的嚴重損傷。氯胺T用量大，或長時間進行碘化反應，結(jié)果并不能使碘利用率和標記多肽、蛋白質(zhì)比放射強度提高多少，反而使標記多肽、蛋白活性下降。當用不含還原劑或還原劑很少的放射性碘源時，試以各種蛋白質(zhì)（包括白蛋白、球蛋白、ACTH、胰島素等）作微量標記，當氯胺T用量為20μg/0.1ml反應液、0～20。C反應20s，碘利用率都已接近或達到最大峰，再加大氯胺T用量和延長反應時間是沒有必要的。隨放射性碘源中還原劑增多，氯胺T用量也應增加，以達到預期的碘利用率，但決不應盲目加大氯胺T用量和延長碘化反應時間（通常反應時間不要超過1min），否則會導致標記多肽、蛋白質(zhì)嚴重失活，不能用于實驗。當然，減少氯胺T用量要在了解放射性碘源還原劑含量的基礎上，否則碘源中還原劑量較多，雙盲目減少氯胺T用量，就會使標記失敗。一般用125I標記時，氯胺T用量要適當加大。加入氯胺T后必須迅速混勻，以防標記不均勻。氯胺T與偏重亞硫酸鈉溶液要新配制的。

　　氯胺T用量減少了，Na2S2O5用量也就可以隨之減少。為保證按時終止碘化反應，實驗時加入Na2S2O5一般都是過量的。氯胺T用量大時，加入Na2S2O5的剩余量也就會隨之增加，這就可能加重某些對還原劑敏感的蛋白質(zhì)或多肽生物活性的損傷。為此，Na2S2O5用量也不應過多。只要藥品沒有變質(zhì)、試劑是新配的，以重量計算Na2S2O5加入量與氯胺T相同就足以保證終止碘化反應（按反應克分子濃度計算，Na2S2O5/氯胺T重量比約0.4），不要盲目加大用量，并應迅速將標記多肽、蛋白質(zhì)從反應液中分離出來，以盡量減少多肽、蛋白質(zhì)活性的損傷。

　　某些蛋白質(zhì)或多肽對氯胺T較敏感，還可進一步減少氯胺T用量、縮短碘化反應時間、降低反應溫度，以保護蛋白質(zhì)的活性。這對一些較容易喪失活性蛋白質(zhì)或多肽的碘標記十分重要。

　　（4）碘化反應體積：系指加入Na2S2O5終止反應前液體的總量。碘化反應體積愈小，局部反應物濃度愈高，所得碘利用率和標記多肽、蛋白比放射強度就愈高。所以，標記應采用比放射標記效果。當反應液量少（<0.2～0.3ml）時，反應體積對碘利用率和標記多肽、蛋白質(zhì)比放射強度的高低影響較大；當反應液量大（>0.5～1.0ml）時則影響較小。微量氯胺T法放射碘標記時，一般多控制碘化反應體積<100μl。

　�。�5）碘化反應溫度：溫度升高，碘化反應速度加快，碘利用率有所增加。但總的來看，反應溫度的影響不很大，一般從0℃到20℃碘利用率相差不過百分之幾，故一般在室溫下進行標記操作就可能獲得重復性好的結(jié)果。有些蛋白質(zhì)或肽類極易喪失活性，則可在0℃進行碘化反應。

　　（6）碘化反應的pH值：受氧化劑氧化生成的活性碘，對多肽鏈的酪氨酸基苯環(huán)羥基鄰位的碘化作用，最適pH是7.3～7.8之間。當pH變化時，碘化位置也會發(fā)生變化，例如pH值較高時，組氧酸的咪唑環(huán)也可被碘化；當pH4～5時，活性碘能迅速氧化色氨酸基生成羥基吲哚，導致肽鏈斷裂。這些都會影響蛋白質(zhì)或多肽的放射性碘化反應，或引起降解或失活。因此作放射性碘化標記時，除放射性碘源外，所有的試劑都應用適當?shù)木彌_液配制，保證碘化反應在最佳pH條件下進行。

　�。�7）微量蛋白質(zhì)或多肽的吸附損失：界面的吸附損失，在使用大量蛋白質(zhì)或多肽類時是可以忽略的，但作微量法標記時投入的蛋白質(zhì)或多肽類只在微克甚至毫克甚至毫微克水平，界面吸附導致的損失就不能忽略。例如制備131I—ACTH時，所用ACTH濃度低到50Pg/ml時，因表面吸附可損失10%～30%，甚至高達75%。改變pH、加入非特異性載體蛋白、或使用聚苯乙烯、聚乙烯容器時，能減少吸附，但不能完全消除。一般殘留在反應管和滴管上的放射性為投入總放射性的2%～8%、殘留在層析柱上折占5%～10%。殘留量隨標記蛋白比放射性強度而直線增減，殘留者幾乎全部都是標記蛋白。由此可見，微量蛋白質(zhì)或多肽受吸附而損失的量是不容忽略的。由于微量蛋白質(zhì)、多肽會被顯著吸附而丟失，所以標記時投入蛋白質(zhì)、多肽量過微（如<2μg）也是不適宜的，否則標記蛋白質(zhì)、多肽的收回率會太低，并在計算上會造成較大的誤差。

　�。�8）不同蛋白質(zhì)、多肽碘化標記的差別：由于不同的蛋白質(zhì)和多肽分子中含有的酪氨酸數(shù)目不同，而且其空間結(jié)構(gòu)也不相同，分子中的酪按酸殘基有的容易發(fā)生碘化反應，有的就不容易碘化，因此同樣條件下進行碘化標記，不同蛋白質(zhì)或多肽對碘的利用率是不相同的。不同蛋白質(zhì)經(jīng)碘化標記后生物活性受損的情況也各不相同。例如ACTH、促性腺激素釋放激素（GRH）、促黃體激素釋放激素（LRH）等多肽，碘化標記后容易喪失激素活性或與受體結(jié)合的活性；而AFP及人絨毛膜促性腺激素（HCG）等的碘化標記，則較容易保存良好的免疫化學活性。

　　盡管不同多肽、蛋白度的碘化標記結(jié)果有所差別，但上述討論的因素對不同多肽、蛋白質(zhì)碘化標記的影響有共同的規(guī)律。掌握了這些因素，就容易成功地獲得合格的標記物。

　　不同多肽、蛋白質(zhì)的分子量大小、理化性質(zhì)各不相同，放射碘化標記反應后，可根據(jù)具體情況采取不同的方法將標記蛋白質(zhì)（或多肽）與未反應的游離放射性碘及受損傷的標記物分開，常用的方法有凝膠過濾、離子交換層析、吸附層析、各種電泳法等。