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內(nèi)標在傳統(tǒng)定量PCR中的意義

放大字體  縮小字體 發(fā)布日期:2006-07-06

內(nèi)參照法
  在不同的PCR反應管中加入已定量的內(nèi)標和引物,內(nèi)標用基因工程方法合成。上游引物用熒光標記,下游引物不標記。在模板擴增的同時,內(nèi)標也被擴增。在PCR產(chǎn)物中,由于內(nèi)標與靶模板的長度不同,二者的擴增產(chǎn)物可用電泳或高效液相分離開來,分別測定其熒光強度,以內(nèi)標為對照定量待檢測模板。

競爭法
  選擇由突變克隆產(chǎn)生的含有一個新內(nèi)切位點的外源競爭性模板。在同一反應管中,待測樣品與競爭模板用同一對引物同時擴增(其中一個引物為熒光標記)。擴增后用內(nèi)切酶消化PCR產(chǎn)物,競爭性模板的產(chǎn)物被酶解為兩個片段,而待測模板不被酶切,可通過電泳或高效液相將兩種產(chǎn)物分開,分別測定熒光強度,根據(jù)已知模板推測未知模板的起始拷貝數(shù)。

PCR-ELISA法
  利用地高辛或生物素等標記引物,擴增產(chǎn)物被固相板上特異的探針所結(jié)合,再加入抗地高辛或生物素酶標抗體-辣根過氧化物酶結(jié)合物,最終酶使底物顯色。常規(guī)的PCR-ELISA法只是定性實驗,若加入內(nèi)標,作出標準曲線,也可實現(xiàn)定量檢測目的。

內(nèi)標在傳統(tǒng)定量中的作用
   由于傳統(tǒng)定量方法都是終點檢測,即PCR到達平臺期后進行檢測,而PCR經(jīng)過對數(shù)期擴增到達平臺期時,檢測重現(xiàn)性極差。同一個模板在96孔PCR儀上做96次重復實驗,所得結(jié)果有很大差異,因此無法直接從終點產(chǎn)物量推算出起始模板量。加入內(nèi)標后,可部分消除終產(chǎn)物定量所造成的不準確性。但即使如此,傳統(tǒng)的定量方法也都只能算作半定量、粗略定量的方法。

 

 

 
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