一）基因組DNA分離、純化和加工

[Mbo I酶檢測]

1．準備1.5ml小試管4個；每管內(nèi)含有：

基因組DNA（在TE或水中） 10.0μg

10×Mbo I緩沖液 2.5μl

H2O 12.0μl

2．向每管中分別加入：0.1，0.5，1或2單位的Mbo I酶。

3．37℃保溫到5，10，20，40分鐘后，分別從每管中移出6μl，在干冰中貯存到下一步時一并使用。

4．把16個樣品在瓊脂糖凝膠中進行電泳，并與標(biāo)準分子量進行比較。

5．選擇參數(shù)為：能產(chǎn)生平均大小約20kb的時間和Mbo I的濃度。

[Mbo I酶切]

1．根據(jù)上述酶切檢測結(jié)果，選用最佳酶切條件，并把酶的量加大100倍，用以消化1mg的基因組DNA；取1個10~15ml的塑料管，加入：

含1mg基因組DNA 1.0ml

Mbo I 按所測定的量加

10×Mbo I緩沖液 250.0μl

H2O 1.2ml

按前述（5）中所測定出的時間（產(chǎn)生20kb）于37℃保溫。

2．用2.5ml 1：1酚和氯仿混合物抽提DNA.

3．把上層水相移入一新管中，加275μl 5M的NaCl。

4．加7ml乙醇，置冰水浴中沉淀10分鐘。

5．4℃，12 000g離心10分鐘。

6．倒除乙醇，重懸DNA于500μl TE緩沖液中，重懸過程在4℃中需數(shù)小時。

7．為獲得大小合適的DNA片段，將步驟6中的DNA分作6分（每分約80μl），分別放在含蔗糖梯度密度Beckman Ultra-clear SW41超離心管中，各通過蔗糖梯度密度儀。在含10~40%的蔗糖，20 mM Tris（pH7.4），10mM EDTA，1M NaCl等濃度中形成線性梯度。

8．135 000g 20℃離心16小時。

次日

9．用粗針頭在每一管的底部刺一小孔（依次收集6管中的DNA）每管按12滴（350~500μl）作為一分收集入a, b, c…數(shù)管中，然后再收集第二管、第三管等依次并入a, b, c各管中。

10． 從每分中都取10μl樣品加10μl水稀釋、4μl載樣緩沖液、用0.4%瓊脂糖凝膠電泳，然后與Hind Ⅲ酶切的λDNA標(biāo)準分子量作比較，以確定那一分中所含片段為10~20kb大小。

11． 將含有16~20kb片段的管子并在一起，加2.5倍體積的乙醇，-20℃冷凍數(shù)小時。

第三天

12．10 000g 4℃離心10分鐘，收集DNA。

13．棄上清液，重懸于160μl TE緩沖液中。

14．對大小合適的片段（16~20kb）再按8~13重復(fù)梯度分離，但此次只用兩個管子即可；每管中各用80μl DNA。第二次蔗糖梯度分離后，將沉淀的DNA懸浮在50μl TE緩沖液中。

第四天

15．取2.5μl樣品（用溴化乙錠染色），與已知濃度和片段大小的DNA片段在瓊脂糖凝膠中電泳后，比較兩者染色強度，估算出DNA濃度，并確證所制備出插入片段的不同大小。

16．把樣品DNA濃度調(diào)到0.25μl/ml，-20℃貯存?zhèn)溆谩?/p>

二）用于基因克隆載體DNA（噬菌體DNA）的制備

1. 用BamH I酶切EMBL3 DNA，加：

EBML3 DNA(500μg) 500μl

10×BamH I緩沖液 100μl

BamH I (10U/μl) 100μl

H2O 300μl

2. 于37℃保溫2小時。

3. 每管中加1體積（500μl）SS-酚和氯仿（1：1）混合物。充分混勻，于微型離心機中離心2分鐘以分離兩相，吸取上清水相至新管。

4. 在每管中加500μl氯仿，充分混勻，離心2分鐘，分相。

5. 吸水相轉(zhuǎn)入新管。

6. 在各試管中加50μl 5M NaCl，再加1ml乙醇。冰水浴中冷卻10分鐘。

7. 在微型離心機中4℃離心5分鐘。

8. 棄去上清液，加1ml 80%乙醇洗滌沉淀物，離心棄去液體。

9. DNA沉淀物真空干燥。

10. 用500μl TE緩沖液溶解沉淀物。

11. EcoR I酶切EBML3 DNA，加：

從步驟10中所獲DNA 500μl

10×EcoR I緩沖液 100μl

EcoR I (1 000U) 100μl

H2O 300μl

12. 于37℃保溫4小時。

13. 按3-9抽提、沉淀并回收。

14. 用500μl TE緩沖液溶解沉淀物。

15. 異丙醇沉淀：在步驟14中得到的500μl DNA于1.5ml離心管中加：3M 醋酸鈉（pH6.0）75μl，異丙醇（在1.5ml微型離心管中）300μl。

16. 冰水浴中置15分鐘。

17. 在微型離心機中4℃離心10分鐘。

18. 棄上清液，用200μl 0.35M醋酸鈉和乙醇（1：2.5）溶液洗滌沉淀物。

19. 在微型離心機中4℃離心10分鐘。

20. 重復(fù)步驟18和19。

21. 棄去上清液，真空干燥沉淀物。

22. 以0.5μg/μl濃度溶解于TE緩沖液中。

23. -20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

三）基因組DNA和載體噬菌體DNA的連接和包裝

1．可按下列步驟在5個1.5ml的小離心管中（用筆標(biāo)記上從A到E）加入下列試劑：10×連接酶緩沖液1.0μl，載體臂DNA（0.5μg/μl）2.0μl。

2．再往每管中加：

 A
 B
 C
 D
 E
 
Mbo I插入片段（0.25μg/μl）
 -
 1μl
 2μl
 3μl
 4μl
 
H2O
 6μl
 5μl
 4μl
 3μl
 2μl
 
T4 DNA連接酶
 1μl
 1μl
 1μl
 1μl
 1μl
 
每管總量10μl
 
 
 
 
 
 

3. 令其充分混合，離心，于14℃保溫12~16小時，連接物可在-20℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

4. 包裝方法：為簡便起見，可購買包裝抽提物。各管子中的10μl連接液都用于包裝，按產(chǎn)品說明書進行操作。包括將連接物和包裝抽提液混合，然后22℃保溫2小時。

5. 包裝混合液用TMG緩沖液稀釋至250μl，包裝后的DNA于4℃保存，切勿冷凍。

6. 取等分稀釋液，倒平板，確定建庫的最適比例；然后按最適比例一系列連接和包裝反應(yīng)，再合并。構(gòu)建文庫要測效價和倒平板，以便供篩選和擴增之用。

四） 測效價和制備文庫平板

1．取500ml消毒培養(yǎng)瓶，注入100ml消毒LB培養(yǎng)液，再接種入2ml含有新鮮LE392細菌的麥芽糖液，培養(yǎng)至OD600近1.0。

2．收集細胞分別于兩個帶螺旋帽50ml聚苯乙烯管中；2500g離心10分鐘。

3．棄上清，把每一沉淀物重懸入25ml消毒的10mM MgSO4中。

4．LE392細胞在4℃中可存兩周；貯存過長會降低接種存活率。

5．接種噬菌體和測效價：從每250μl包裝反應(yīng)液中取1μl（從前（三）中5），加入到99μl TMG中，分1μl和10μl此稀釋液加入13mm（直徑）×100mm（長）消毒管中；同時也稀釋和鋪制克隆載體平板、連接和包裝，但無插入（三種A管），作為本底對照。

6．從4步驟向每管中加200μl LE392細菌，混勻，室溫孵育20分鐘。

7．加2.5ml含有10 mM MgSO4的上層瓊脂（48℃）；在室溫中把每管立即倒入瓊脂平板上，旋動，令上層瓊質(zhì)分散均勻。

8．室溫中置5分鐘，令瓊脂變硬，反置平板，37℃中培養(yǎng)8~16小時，當(dāng)LE392細胞長滿后，由于溶菌作用，空斑形成將非常明顯。

9．計算每一包裝反應(yīng)效價，統(tǒng)計每一平板空斑數(shù)，理想濃度的插入片段的效價應(yīng)是：如建立文庫成功，與無插入對照文庫相比，至少大5~10倍。

10． 放大：如需放大，應(yīng)用足夠反應(yīng)樣品去建庫，在最適條件下重復(fù)連接和包裝反應(yīng)，但不擴大反應(yīng)規(guī)模；對哺乳動物基因組，理想的目標(biāo)文庫大小是1~2×106噬菌斑，合并包裝混合物，并通過倒平板計算噬菌斑數(shù)，用來測定其效價，或文庫的含量。

11． 以下7個步驟是倒平板供文庫篩選，如果篩選前要擴增文庫，則可按六、文庫擴增法進行，然后再回到步驟12。

12． 文庫倒平板篩選：要篩選5×105~106噬菌斑，一般每個90mm LB瓊脂平板上有104噬菌體；先取20ml LE392細胞；裝入50ml無菌帶帽塑料試管中，在細菌中加入已知效價的包裝混合液5×105~106噬菌斑，混合。

13． 室溫中置20分鐘，令噬菌體附到細胞上。

14． 在50~100個13×100mm的無菌玻璃試管中各加200μl受吸附的細菌。

15． 室溫下每管各加2.5ml 48℃融化的無菌LB上層瓊脂糖，并立即倒在LB瓊脂平板上，搖動使之分布均勻，連續(xù)倒完全部平板。

16． 室溫下置15分鐘，使上層瓊脂糖凝固，于37℃倒置培養(yǎng)8~16小時。

17． 此間將出現(xiàn)噬菌斑。

18． 4℃保存平板。

五） 用放射性探針篩選已倒平板的文庫

1. 將瓊脂平板翻轉(zhuǎn)，令瓊脂面下，去掉培養(yǎng)皿蓋，在室溫中空氣干燥30分鐘。

1．給每個培養(yǎng)皿編號，用筆在對應(yīng)的NC濾膜上編號。

2．把濾膜小心地鋪在瓊脂平板上，編號朝上，濾膜0.5~1分鐘內(nèi)變濕，持續(xù)20分鐘使噬菌斑吸附到NC濾膜上。

3．用一根干凈的18號針頭穿過濾膜和瓊脂糖，戳5~10個孔，使濾膜在瓊脂糖膜上定位（此步很重要）。

4．用扁鉗小心緩慢從平板上揭下濾膜，注意不要掀起含噬菌體的瓊脂糖層，用記號筆在培養(yǎng)皿底部標(biāo)記針孔。

5．令號碼面朝下，在室溫中置30分鐘讓濾膜干燥，每個平板可再影印第2張濾膜，此對消除假陽性信號很有用，因所有的真陽性應(yīng)在兩張膜的同一位置上雜交，另外，第二張濾膜也可用第二種探針雜交。

6．將濾膜相繼浸入100ml下列3種溶液中（30~60秒/每次）：

a. 0.2M NaOH，1.5M NaCl

b. 2×SSC，0.4M Tris pH7.4

c. 2×SSC

每浸潤25張濾膜后更換一次溶液

7．硝酸纖維素膜面朝上，放置在Whatman 3mm紙上，室溫種干燥1小時。

8．80℃真空干燥2小時。

9． 用雜交緩沖液濕潤所有濾膜，切口平移的探針用緩沖液-N，合成探針用緩沖液-S。

10． 在1只1L燒杯中，放入濾膜和足夠量的雜交緩沖液，浸泡濾膜。

11． 準備雜交探針：將比活性為108cmp/μg的切口平移探針0.25μg加到1個帶螺紋帽的50ml試管中，加0.5ml 2mg/ml的鮭魚精子DNA溶液，再依次加入下列溶液并振蕩混合使其變形：10M NaOH 50μl; 2M Tris pH7.4 300μl; 1M HCl（延壁加）500μl。

12． 將此變性的探針加到放有濾膜和緩沖液的燒杯中，旋轉(zhuǎn)均勻。

13． 于42℃振蕩（輕輕搖動）4~16小時，使切口平移探針雜交（合成探針的保溫溫度不同）。

14． 倒出燒杯中的雜交緩沖液，用500ml含0.1%SDS(W/V)2×SSC溶液在室溫中搖動15分鐘。

15． 按步驟15再洗兩次，低鹽洗滌前用吸水紙吸干所有濾膜。

16． 用含0.1%SDS(W/V)0.1×SSC 500ml，52℃洗滌濾膜兩次，每次15分鐘。

17． 倒去洗滌緩沖液，用Whatman 3mm濾紙吸干濾膜，在空氣中干燥1小時。

18． 將NC濾膜貼在3mm濾紙上，用放射性墨水標(biāo)記3mm濾值；濾膜用干凈塑料紙包好，用增強屏在XAR-5底片下于-70℃曝光過夜，檢測陽性信號。

第二次篩選

19． 將200μl LE392指示菌加到13×100mm試管中。加2.5ml含10mM MgSO4的48℃ LB上層瓊脂，室溫下立即倒入90mm的LB瓊脂板上，靜止5分鐘使之凝固，形成細菌苔，在培養(yǎng)皿底劃50個格子，供第二次噬菌體的生長。

20． 按照膜上放射性墨水標(biāo)記與X光底片對齊，用標(biāo)記筆將膜上的位置孔標(biāo)記在底片上，用透射光幫助對齊。

21． 根據(jù)放射自顯影信號，用牙簽挑取陽性噬菌體斑或其附近噬菌體。

22． 將牙簽上噬菌體斑，點在各個菌苔方格里，只要將牙簽尖在菌苔上輕輕觸一下即可。

23． 倒置平板，37℃培養(yǎng)過夜。

24． 加蓋NC濾膜，篩選，按步驟1-19進行。

第三次篩選

25． 用牙簽轉(zhuǎn)移來自每一個原始陽性信號的第二輪單個雜交噬菌斑中的噬菌體，每個牙簽可轉(zhuǎn)移106~107個噬菌體顆粒。

26． 將牙簽放進盛有10ml無菌TMG緩沖液的無菌管中，劇烈振蕩混合，以混勻噬菌體。

27． 將步驟27的TMG混合液0.25μl和2.5μl放入兩個含有200μl LE 392倒平板細胞的13×100mm管子內(nèi)，加2.5ml 48℃含10mM MgSO4的LB上層瓊脂，室溫下立即倒在90mm的LB瓊脂板上，搖動使之分布均勻，室溫下凝固15分鐘。

28． 倒置平板，37℃培養(yǎng)過夜，每個平板應(yīng)形成50~500個噬菌斑。

29． 用干凈牙簽從100~200個單獨分開的噬菌斑中，把噬菌體轉(zhuǎn)移到長有LE392菌苔的平板上。

30． 倒置平板，37℃培養(yǎng)過夜。

31． 按步驟1-19對格子里的噬菌體作第三次雜交和篩選。陽性信號為純化的噬菌斑克隆，每一個來自初始陽性信號的“戰(zhàn)勝者”，按步驟26用牙簽轉(zhuǎn)移到5ml TMG液。

32． 加1μl TMG混合液到200μl LE392到平板細胞中，按步驟28和29進行，37℃倒置培養(yǎng)過夜。

33． 此平板上所有的噬菌斑，都是該克隆的純化噬菌斑，這平板可用Parafilm封柱，貯于4℃中，作為克隆的原種。平板上的單個噬菌斑，可直接用于這種噬菌體生長的制備。

六）文庫擴增

1．每2×104文庫中的噬菌體在一個無菌的13×100mm試管中同200μl LE392細胞混合。一般說，擴增2×106個噬菌斑的文庫需100個試管，室溫下吸附培養(yǎng)20分鐘。

2．在每個試管中加入含10mM MgSO4 48℃的軟瓊脂2.5ml室溫下立即倒在90mm的LB瓊脂板上，搖動鋪勻，不要倒轉(zhuǎn)平板，否則瓊脂會滑到一邊，37℃培養(yǎng)6~10小時。

3．當(dāng)噬菌體開始形成針尖狀噬菌體斑，而尚未變大連接成片時，加2ml LB培養(yǎng)液，用無菌塑料棒或彎曲的移液玻璃管從平板上刮下軟瓊脂，裝入一個無菌的1L燒杯中，每100ml體積平板上刮下的軟瓊脂中加2ml氯仿。

4．在一末端為圓錐形的無菌離心管中，3000g離心混合物10分鐘，瓊脂和細菌碎片將在管底形成沉淀，輕輕倒出含有擴增文庫的上清液。

5．測定文庫體積：加NaCl晶體至種濃度為1M。

6．稀釋和倒平板，以測定擴增文庫效價，標(biāo)準的效價為每1ml 5×109~1010個噬菌體。

7．將文庫分裝在1ml無菌管中，每管加3滴氯仿，4℃貯存。

8．在倒平板和篩選前再測定文庫效價。