鍵合相色譜法是由液－液色譜法即分配色譜發(fā)展起來的。鍵合相色譜法將固定相共價(jià)結(jié)合在載體顆粒上，克服了分配色譜中由于固定相在流動(dòng)中有微量溶解，及流動(dòng)相通過色譜柱時(shí)的機(jī)械沖擊，固定相不斷損失，色譜柱的性質(zhì)逐漸改變等缺點(diǎn)。鍵合相色譜法可分為正常相色譜法和反相色譜法。
1.正常相色譜法
在正常相色譜法中共價(jià)結(jié)合到載體上的基團(tuán)都是極性基團(tuán)，如一級氨基、氰基、二醇基、二甲氨基和二氨基等。流動(dòng)相溶劑是與吸附色譜中的流動(dòng)相很相似的非極性溶劑，如庚烷、已烷及異辛烷等。由于固定相是極性，因此流動(dòng)溶劑的極性越強(qiáng)，洗脫能力也越強(qiáng)，即極性大的溶劑是強(qiáng)溶劑。固定相與流動(dòng)相的這種關(guān)系正好與液－固色譜法相同，稱這種色譜法為正常相色譜法。盡管如此，正常相色譜法的分離原理主要根據(jù)化合物在固定相及流動(dòng)相中分配系數(shù)的不同進(jìn)行分離，它不適于分離幾何異構(gòu)體。
2.反相色譜法
在反相色譜法中共價(jià)結(jié)合到載體上的固定相是一些直鏈碳?xì)浠衔铮缯粱�。流�?dòng)相的極性比固定相的極性強(qiáng)。反相色譜法在高效液相色譜法中應(yīng)用最廣泛。 在反相色譜法中，使溶質(zhì)滯留的主要作用是疏水作用，在高效液相色譜中又被稱為疏溶劑作用。所謂疏水作用即當(dāng)水中存在非極性溶質(zhì)時(shí)，溶質(zhì)分子之間的相互作用 、溶質(zhì)分子與水分子之間的相互作用遠(yuǎn)小于水分子之間的相互作用， 因此溶質(zhì)分子從水中被“擠”了出去。可見反相色譜中疏水性越強(qiáng)的化合物越容易從流動(dòng)相中擠出去，在色譜柱中滯留時(shí)間也長，所以反相色譜法中不同的化合物根據(jù)它們的疏水特性得到分離。反相色譜法適于分離帶有不同疏水基團(tuán)的化合物，亦即非極性基團(tuán)的化合物。此外，反相色譜法可用于分離帶有不同極性基團(tuán)的化合物�？梢酝ㄟ^改變流動(dòng)相的溶劑及其組成和pH，以影響溶質(zhì)分子與流動(dòng)相的相互作用，改變它們的滯留行為。另外，反相色譜中水的流動(dòng)相中占的比例伸縮性很大，可以／從0-100％，從而使反相色譜可用于水溶性、脂溶性化合物的分離。反相色譜法中的固定相是被共價(jià)結(jié)合到硅膠載體上的直鏈飽和和烷烴，其鏈的長短不同，最長的是十八烷基，這也是使用得最多的固定相。直鏈飽和烷烴疏水特性隨著碳?xì)滏湹拈L度而增加，在反相色譜柱中溶質(zhì)由于疏水作用而滯留的時(shí)間也將隨著碳?xì)滏湹拈L度而增加。在一般情況下這意味著用碳?xì)滏滈L的反相色譜柱能得到較好的分辯率，在多數(shù)情況下是依靠反復(fù)來選擇色譜柱。由于反相色譜法的固定相是疏水的碳?xì)浠衔铮苜|(zhì)與固定相之間的作用主要是非極性相互作用，或者說疏水相互作用，因此溶劑的強(qiáng)度隨著極性降低而增加。水是極性最強(qiáng)的溶劑，也是反相色譜中最弱的溶劑。在反相色譜中常常用和基礎(chǔ)溶劑，向其中加入不同濃度的、可以與水混溶的有機(jī)溶劑，以得到不同強(qiáng)度的流動(dòng)相，這些有機(jī)溶劑稱為修飾劑。反相色譜中最常用的有機(jī)溶劑有甲醇和乙腈，此外，乙醇、四氫呋喃、異丙醇及二氧六環(huán)也常被用作修飾劑。
在生化分析中，反相色譜的應(yīng)用極廣。可用于①氨基酸和多肽的分析；②蛋白質(zhì)的分離；③堿基，核酸和核酸酶的分析；④甾體化合物的分析；⑤以及其他如幾茶酚胺類，組胺，糖及維生素的分離。
1.正常相色譜法
在正常相色譜法中共價(jià)結(jié)合到載體上的基團(tuán)都是極性基團(tuán)，如一級氨基、氰基、二醇基、二甲氨基和二氨基等。流動(dòng)相溶劑是與吸附色譜中的流動(dòng)相很相似的非極性溶劑，如庚烷、已烷及異辛烷等。由于固定相是極性，因此流動(dòng)溶劑的極性越強(qiáng)，洗脫能力也越強(qiáng)，即極性大的溶劑是強(qiáng)溶劑。固定相與流動(dòng)相的這種關(guān)系正好與液－固色譜法相同，稱這種色譜法為正常相色譜法。盡管如此，正常相色譜法的分離原理主要根據(jù)化合物在固定相及流動(dòng)相中分配系數(shù)的不同進(jìn)行分離，它不適于分離幾何異構(gòu)體。
2.反相色譜法
在反相色譜法中共價(jià)結(jié)合到載體上的固定相是一些直鏈碳?xì)浠衔铮缯粱�。流�?dòng)相的極性比固定相的極性強(qiáng)。反相色譜法在高效液相色譜法中應(yīng)用最廣泛。 在反相色譜法中，使溶質(zhì)滯留的主要作用是疏水作用，在高效液相色譜中又被稱為疏溶劑作用。所謂疏水作用即當(dāng)水中存在非極性溶質(zhì)時(shí)，溶質(zhì)分子之間的相互作用 、溶質(zhì)分子與水分子之間的相互作用遠(yuǎn)小于水分子之間的相互作用， 因此溶質(zhì)分子從水中被“擠”了出去。可見反相色譜中疏水性越強(qiáng)的化合物越容易從流動(dòng)相中擠出去，在色譜柱中滯留時(shí)間也長，所以反相色譜法中不同的化合物根據(jù)它們的疏水特性得到分離。反相色譜法適于分離帶有不同疏水基團(tuán)的化合物，亦即非極性基團(tuán)的化合物。此外，反相色譜法可用于分離帶有不同極性基團(tuán)的化合物�？梢酝ㄟ^改變流動(dòng)相的溶劑及其組成和pH，以影響溶質(zhì)分子與流動(dòng)相的相互作用，改變它們的滯留行為。另外，反相色譜中水的流動(dòng)相中占的比例伸縮性很大，可以／從0-100％，從而使反相色譜可用于水溶性、脂溶性化合物的分離。反相色譜法中的固定相是被共價(jià)結(jié)合到硅膠載體上的直鏈飽和和烷烴，其鏈的長短不同，最長的是十八烷基，這也是使用得最多的固定相。直鏈飽和烷烴疏水特性隨著碳?xì)滏湹拈L度而增加，在反相色譜柱中溶質(zhì)由于疏水作用而滯留的時(shí)間也將隨著碳?xì)滏湹拈L度而增加。在一般情況下這意味著用碳?xì)滏滈L的反相色譜柱能得到較好的分辯率，在多數(shù)情況下是依靠反復(fù)來選擇色譜柱。由于反相色譜法的固定相是疏水的碳?xì)浠衔铮苜|(zhì)與固定相之間的作用主要是非極性相互作用，或者說疏水相互作用，因此溶劑的強(qiáng)度隨著極性降低而增加。水是極性最強(qiáng)的溶劑，也是反相色譜中最弱的溶劑。在反相色譜中常常用和基礎(chǔ)溶劑，向其中加入不同濃度的、可以與水混溶的有機(jī)溶劑，以得到不同強(qiáng)度的流動(dòng)相，這些有機(jī)溶劑稱為修飾劑。反相色譜中最常用的有機(jī)溶劑有甲醇和乙腈，此外，乙醇、四氫呋喃、異丙醇及二氧六環(huán)也常被用作修飾劑。
在生化分析中，反相色譜的應(yīng)用極廣。可用于①氨基酸和多肽的分析；②蛋白質(zhì)的分離；③堿基，核酸和核酸酶的分析；④甾體化合物的分析；⑤以及其他如幾茶酚胺類，組胺，糖及維生素的分離。