一、概要
硝基呋喃類藥物因有非常好的抗菌作用和藥動力學(xué)的特性,曾經(jīng)被廣泛應(yīng)用,作為禽類、水產(chǎn)和豬促生長的添加劑。但在長時間的實(shí)驗(yàn)研究過程中發(fā)現(xiàn),硝基呋喃類藥物和代謝物均可以使實(shí)驗(yàn)動物發(fā)生癌變和基因突變,正因?yàn)槿绱瞬艑?dǎo)致此類藥物禁止在治療和飼料中使用
用來檢測呋喃西林代謝物的最常用方法是LC-UV,LC-MS和LC-MS/MS。酶聯(lián)免疫方法結(jié)合了色譜技術(shù),采用SEM衍生物的特異性抗體,具有很高的精確度和靈敏度,較低的操作技術(shù)要求和短暫的檢測時間,檢測樣品量大等特點(diǎn)在檢測中很好的表現(xiàn)出來。
本試劑盒是應(yīng)用ELISA技術(shù)研發(fā)而成的檢測產(chǎn)品,能最大限度地減少操作誤差和工作強(qiáng)度。
二、試驗(yàn)原理
本試劑盒采用間接競爭ELISA方法,在酶標(biāo)板微孔條上預(yù)包被呋喃西林代謝物抗原,樣品殘留的呋喃西林代謝物和微孔條上預(yù)包被的抗原競爭抗呋喃西林代謝物抗體,加入酶標(biāo)二抗后,經(jīng)TMB底物顯色,樣品吸光度值與其殘留物呋喃西林代謝物呈負(fù)相關(guān),與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較再乘以其對應(yīng)的稀釋倍數(shù),即可得出樣品中呋喃西林代謝物的含量。
三、適用范圍
可定性、定量檢測動物組織(雞、豬),蜂蜜樣品中的呋喃西林代謝物的殘留量。
四、交叉反應(yīng)率
呋喃西林代謝物…………………………………… 100%
呋喃它酮代謝物…………………………………小于 0.1%
呋喃妥因代謝物 …………………………………小于 0.1%
呋喃唑酮代謝物………………………………………小于0.1%
五、檢測步驟
測定前應(yīng)須知:
1、使用之前將所有試劑和需用板條的溫度回升至室溫(20~25℃)。
2、使用之后立即將所有試劑放回2~8℃。
3、在ELISA分析中的再現(xiàn)性,很大程度上取決于洗板的一致性,正確的洗板操作是ELISA測定程序中的要點(diǎn)。
4、在所有恒溫孵育過程中,避免光線照射,用蓋板膜封住微孔板。
操作步驟:
1、將所需試劑從冷藏環(huán)境中取出,置于室溫(20~25℃)平衡30min以上,注意每種液體試劑使用前均須搖勻。
2、取出需要數(shù)量的微孔板,將不用的微孔放入自封袋,保存于2~8℃。
3、洗滌工作液在使用前也需回溫。
4、編號:將樣品和標(biāo)準(zhǔn)品對應(yīng)微孔按序編號,每個樣品和標(biāo)準(zhǔn)品做2孔平行,并記錄標(biāo)準(zhǔn)孔和樣品孔所在的位置。
5、加標(biāo)準(zhǔn)品/樣本:加標(biāo)準(zhǔn)品/樣本50l/孔到對應(yīng)的微孔中,再加入呋喃西林代謝物酶標(biāo)物50l/孔,再加入呋喃西林代謝物抗試劑50ul/孔輕輕振蕩混勻,用蓋板膜蓋板后置25℃避光環(huán)境中反應(yīng)30min。
6、洗板:小心揭開蓋板膜,將孔內(nèi)液體甩干,用洗滌工作液250l/孔,充分洗滌4~5次,每次間隔10s,用吸水紙拍干(拍干后未被清除的氣泡可用未使用過的槍頭戳破)。
7、顯色:加入底物液A液50l/孔,再加底物液B液50l/孔,輕輕振蕩混勻,用蓋板膜蓋板后置25℃避光環(huán)境中反應(yīng)15~20min。
8、測定:加入終止液50l/孔,輕輕振蕩混勻,設(shè)定酶標(biāo)儀于450nm處(建議用雙波長450/630nm檢測,請?jiān)?min內(nèi)讀完數(shù)據(jù)),測定每孔OD值。(若無酶標(biāo)儀,則不加終止液用目測法可進(jìn)行判定)。
六、檢測方法靈敏度、準(zhǔn)確度、精密度
試劑盒靈敏度:0.05ppb
檢測限:
組織、蜂蜜樣品檢測下限…………………………………0.1ppb
回收率:
水產(chǎn)、肌肉、肝臟蜂蜜組織 ………………………… 80±15%
精密度:試劑盒的變異系數(shù)均小于10%
七、注意事項(xiàng)
1、室溫低于20℃或試劑及樣品沒有回到室溫(20~25℃)會導(dǎo)致所有標(biāo)準(zhǔn)的OD值偏低。
2、在洗板過程中如果出現(xiàn)板孔干燥的情況,則會出現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)曲線不成線性,重復(fù)性不好的現(xiàn)象。所以洗板拍干后應(yīng)立即進(jìn)行下一步操作。
3、每加一種試劑前需將其搖勻。
4、反應(yīng)終止液為2M硫酸,避免接觸皮膚。
5、不要使用過了有效日期的試劑盒;也不要使用過了有效期的試劑盒中的任何試劑,摻雜使用過了有效期的試劑盒會引起靈敏度的降低;不要交換使用不同批號試劑盒中的試劑。
6、儲存條件保存試劑盒于2~8℃,不要冷凍,將不用的酶標(biāo)板微孔板放進(jìn)自封袋重新密封。標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和無色的發(fā)色劑對光敏感,因此要避免直接暴露在光線下。
7、試劑變質(zhì)的跡象發(fā)色試劑有任何顏色表明發(fā)色劑變質(zhì),應(yīng)當(dāng)棄之。0標(biāo)準(zhǔn)的吸光度(450/630nm)值小于0.5(A450nm<0.5)時,表示試劑可能變質(zhì)。
8、在加入底物液A液和底物液B液后,一般顯色時間為15~20min即可。若顏色較淺,可延長反應(yīng)時間到25min(或更長),但不得超過30min。反之,則減短反應(yīng)時間。
9、該試劑盒最佳反應(yīng)溫度為25℃,溫度過高或過低將導(dǎo)致檢測吸光度值和靈敏度發(fā)生變化。
八、貯藏條件及保存期
貯藏條件:保存試劑盒于2~8℃。
保存期:該產(chǎn)品有效期為12個月。
硝基呋喃類藥物因有非常好的抗菌作用和藥動力學(xué)的特性,曾經(jīng)被廣泛應(yīng)用,作為禽類、水產(chǎn)和豬促生長的添加劑。但在長時間的實(shí)驗(yàn)研究過程中發(fā)現(xiàn),硝基呋喃類藥物和代謝物均可以使實(shí)驗(yàn)動物發(fā)生癌變和基因突變,正因?yàn)槿绱瞬艑?dǎo)致此類藥物禁止在治療和飼料中使用
用來檢測呋喃西林代謝物的最常用方法是LC-UV,LC-MS和LC-MS/MS。酶聯(lián)免疫方法結(jié)合了色譜技術(shù),采用SEM衍生物的特異性抗體,具有很高的精確度和靈敏度,較低的操作技術(shù)要求和短暫的檢測時間,檢測樣品量大等特點(diǎn)在檢測中很好的表現(xiàn)出來。
本試劑盒是應(yīng)用ELISA技術(shù)研發(fā)而成的檢測產(chǎn)品,能最大限度地減少操作誤差和工作強(qiáng)度。
二、試驗(yàn)原理
本試劑盒采用間接競爭ELISA方法,在酶標(biāo)板微孔條上預(yù)包被呋喃西林代謝物抗原,樣品殘留的呋喃西林代謝物和微孔條上預(yù)包被的抗原競爭抗呋喃西林代謝物抗體,加入酶標(biāo)二抗后,經(jīng)TMB底物顯色,樣品吸光度值與其殘留物呋喃西林代謝物呈負(fù)相關(guān),與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較再乘以其對應(yīng)的稀釋倍數(shù),即可得出樣品中呋喃西林代謝物的含量。
三、適用范圍
可定性、定量檢測動物組織(雞、豬),蜂蜜樣品中的呋喃西林代謝物的殘留量。
四、交叉反應(yīng)率
呋喃西林代謝物…………………………………… 100%
呋喃它酮代謝物…………………………………小于 0.1%
呋喃妥因代謝物 …………………………………小于 0.1%
呋喃唑酮代謝物………………………………………小于0.1%
五、檢測步驟
測定前應(yīng)須知:
1、使用之前將所有試劑和需用板條的溫度回升至室溫(20~25℃)。
2、使用之后立即將所有試劑放回2~8℃。
3、在ELISA分析中的再現(xiàn)性,很大程度上取決于洗板的一致性,正確的洗板操作是ELISA測定程序中的要點(diǎn)。
4、在所有恒溫孵育過程中,避免光線照射,用蓋板膜封住微孔板。
操作步驟:
1、將所需試劑從冷藏環(huán)境中取出,置于室溫(20~25℃)平衡30min以上,注意每種液體試劑使用前均須搖勻。
2、取出需要數(shù)量的微孔板,將不用的微孔放入自封袋,保存于2~8℃。
3、洗滌工作液在使用前也需回溫。
4、編號:將樣品和標(biāo)準(zhǔn)品對應(yīng)微孔按序編號,每個樣品和標(biāo)準(zhǔn)品做2孔平行,并記錄標(biāo)準(zhǔn)孔和樣品孔所在的位置。
5、加標(biāo)準(zhǔn)品/樣本:加標(biāo)準(zhǔn)品/樣本50l/孔到對應(yīng)的微孔中,再加入呋喃西林代謝物酶標(biāo)物50l/孔,再加入呋喃西林代謝物抗試劑50ul/孔輕輕振蕩混勻,用蓋板膜蓋板后置25℃避光環(huán)境中反應(yīng)30min。
6、洗板:小心揭開蓋板膜,將孔內(nèi)液體甩干,用洗滌工作液250l/孔,充分洗滌4~5次,每次間隔10s,用吸水紙拍干(拍干后未被清除的氣泡可用未使用過的槍頭戳破)。
7、顯色:加入底物液A液50l/孔,再加底物液B液50l/孔,輕輕振蕩混勻,用蓋板膜蓋板后置25℃避光環(huán)境中反應(yīng)15~20min。
8、測定:加入終止液50l/孔,輕輕振蕩混勻,設(shè)定酶標(biāo)儀于450nm處(建議用雙波長450/630nm檢測,請?jiān)?min內(nèi)讀完數(shù)據(jù)),測定每孔OD值。(若無酶標(biāo)儀,則不加終止液用目測法可進(jìn)行判定)。
六、檢測方法靈敏度、準(zhǔn)確度、精密度
試劑盒靈敏度:0.05ppb
檢測限:
組織、蜂蜜樣品檢測下限…………………………………0.1ppb
回收率:
水產(chǎn)、肌肉、肝臟蜂蜜組織 ………………………… 80±15%
精密度:試劑盒的變異系數(shù)均小于10%
七、注意事項(xiàng)
1、室溫低于20℃或試劑及樣品沒有回到室溫(20~25℃)會導(dǎo)致所有標(biāo)準(zhǔn)的OD值偏低。
2、在洗板過程中如果出現(xiàn)板孔干燥的情況,則會出現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)曲線不成線性,重復(fù)性不好的現(xiàn)象。所以洗板拍干后應(yīng)立即進(jìn)行下一步操作。
3、每加一種試劑前需將其搖勻。
4、反應(yīng)終止液為2M硫酸,避免接觸皮膚。
5、不要使用過了有效日期的試劑盒;也不要使用過了有效期的試劑盒中的任何試劑,摻雜使用過了有效期的試劑盒會引起靈敏度的降低;不要交換使用不同批號試劑盒中的試劑。
6、儲存條件保存試劑盒于2~8℃,不要冷凍,將不用的酶標(biāo)板微孔板放進(jìn)自封袋重新密封。標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和無色的發(fā)色劑對光敏感,因此要避免直接暴露在光線下。
7、試劑變質(zhì)的跡象發(fā)色試劑有任何顏色表明發(fā)色劑變質(zhì),應(yīng)當(dāng)棄之。0標(biāo)準(zhǔn)的吸光度(450/630nm)值小于0.5(A450nm<0.5)時,表示試劑可能變質(zhì)。
8、在加入底物液A液和底物液B液后,一般顯色時間為15~20min即可。若顏色較淺,可延長反應(yīng)時間到25min(或更長),但不得超過30min。反之,則減短反應(yīng)時間。
9、該試劑盒最佳反應(yīng)溫度為25℃,溫度過高或過低將導(dǎo)致檢測吸光度值和靈敏度發(fā)生變化。
八、貯藏條件及保存期
貯藏條件:保存試劑盒于2~8℃。
保存期:該產(chǎn)品有效期為12個月。