一、概要
慶大霉素(Gentamicin, GEN)屬于氨基糖甙類抗生素,主要作用于革蘭氏陰性細(xì)菌,由于其抗菌譜廣、療效佳且價格低廉而廣泛應(yīng)用于獸醫(yī)臨床和動物飼料添加劑。但GEN的血清有效濃度與毒性濃度很相近,安全范圍較小,在其應(yīng)用過程中易產(chǎn)生毒副作用,尤其大劑量不規(guī)范使用,易導(dǎo)致動物性食品中GEN殘留超標(biāo),對人體健康構(gòu)成危害,對腦神經(jīng)、聽覺以及腎臟的損害嚴(yán)重,F(xiàn)有的檢測慶大霉素方法如色譜法或色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)其樣品前處理復(fù)雜、所需儀器昂貴、操作復(fù)雜、耗費(fèi)時間。而使用慶大霉素ELISA試劑盒能夠既快速又準(zhǔn)確的分析樣品中慶大霉素殘留。
本試劑盒是應(yīng)用ELISA技術(shù)研發(fā)而成的檢測產(chǎn)品,操作時間短于50min,能最大限度地減少操作誤差和工作強(qiáng)度。
二、試驗原理
本試劑盒采用間接競爭ELISA方法,在酶標(biāo)板微孔條上預(yù)包被慶大霉素抗原,樣品殘留的慶大霉素和微孔條上預(yù)包被的抗原競爭抗慶大霉素抗體,加入酶標(biāo)二抗后,加入TMB底物顯色,樣品吸光值與其殘留物慶大霉素成負(fù)相關(guān),與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較再乘以其對應(yīng)的稀釋倍數(shù),即可得出樣品中慶大霉素的含量。
三、適用范圍
可定性、定量檢測牛奶、動物組織等樣品中慶大霉素的殘留量。
四、交叉反應(yīng)率
慶大霉素……………………………………………………100%
五、檢測步驟
測定前應(yīng)須知:
1、使用之前將所有試劑和需用板條的溫度回升至室溫(20~25℃)。
2、使用之后立即將所有試劑放回2~8℃。
3、在ELISA分析中的再現(xiàn)性,很大程度上取決于洗板的一致性,正確的洗板操作是ELISA測定程序中的要點(diǎn)。
4、在所有恒溫孵育過程中,避免光線照射,用蓋板膜封住微孔板。
操作步驟:
1、將所需試劑從冷藏環(huán)境中取出,置于室溫(20~25℃)平衡30min以上,注意每種液體試劑使用前均須搖勻。
2、取出需要數(shù)量的微孔板,將不用的微孔放入自封袋,保存于2~8℃。
3、洗滌工作液在使用前也需回溫。
4、編號:將樣品和標(biāo)準(zhǔn)品對應(yīng)微孔按序編號,每個樣品和標(biāo)準(zhǔn)品做2孔平行,并記錄標(biāo)準(zhǔn)孔和樣品孔所在的位置。
5 加標(biāo)準(zhǔn)品/樣品:加標(biāo)準(zhǔn)品/樣品50l/孔到對應(yīng)的微孔中,然后加入慶大霉素抗試劑50l/孔,輕輕振蕩混勻,用蓋板膜蓋板后置25℃避光環(huán)境中反應(yīng)30min。
6、洗板:小心揭開蓋板膜,將孔內(nèi)液體甩干,用洗滌工作液300l/孔,充分洗滌5次,每次間隔30s,用吸水紙拍干(拍干后未被清除的氣泡可用未使用過的槍頭戳破)。
7、加酶標(biāo)物:加入慶大霉素酶標(biāo)物100l/孔,輕輕振蕩混勻,用蓋板膜蓋板后置25℃避光環(huán)境中反應(yīng)30min,取出重復(fù)洗板步驟6。
8、顯色:加入底物液A液50l/孔,再加底物液B液50l/孔,輕輕振蕩混勻,用蓋板膜蓋板后置25℃避光環(huán)境中反應(yīng)15~20min。
9、測定:加入終止液50l/孔,輕輕振蕩混勻,設(shè)定酶標(biāo)儀于450nm處(建議用雙波長450/630nm檢測,請在5min內(nèi)讀完數(shù)據(jù)),測定每孔OD值。(若無酶標(biāo)儀,則不加終止液用目測法可進(jìn)行判定)。
六、檢測方法靈敏度、準(zhǔn)確度、精密度
試劑盒靈敏度:0.1ppb
樣品最低檢測限:
組織………………………………………………3ppb
牛奶…………………………………………… 3.5ppb
回收率:
組織…………………………………………………80±10%
牛奶………………………………………………… 80±10%
精密度:
試劑盒的變異系數(shù)均小于10%
七、注意事項
1、室溫低于20℃或試劑及樣品沒有回到室溫(20~25℃)會導(dǎo)致所有標(biāo)準(zhǔn)的OD值偏低。
2、在洗板過程中如果出現(xiàn)板孔干燥的情況,則會出現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)曲線不成線性,重復(fù)性不好的現(xiàn)象。所以洗板拍干后應(yīng)立即進(jìn)行下一步操作。
3、每加一種試劑前需將其搖勻。
4、反應(yīng)終止液為2M硫酸,避免接觸皮膚。
5、不要使用過了有效日期的試劑盒;也不要使用過了有效期的試劑盒中的任何試劑,摻雜使用過了有效期的試劑盒會引起靈敏度的降低;不要交換使用不同批號試劑盒中的試劑。
6、儲存條件
保存試劑盒于2~8℃,不要冷凍,將不用的酶標(biāo)板放進(jìn)自封袋重新密封。標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和無色的發(fā)色劑對光敏感,因此要避免直接暴露在光線下。
7、試劑變質(zhì)的跡象發(fā)色試劑有任何顏色表明發(fā)色劑變質(zhì),應(yīng)當(dāng)棄之。0標(biāo)準(zhǔn)的吸光度(450/630nm)值小于0.5(A450nm<0.5)時,表示試劑可能變質(zhì)。
8、在加入底物液A液和底物液B液后,一般顯色時間為15~20min即可。若顏色較淺,可延長反應(yīng)時間到30min(或更長),但不得超過30min。反之,則減短反應(yīng)時間。
9、該試劑盒最佳反應(yīng)溫度為25℃,溫度過高或過低將導(dǎo)致檢測吸光度值和靈敏度發(fā)生變化。
八、貯藏條件及保存期
貯藏條件:保存試劑盒于2~8℃。
保存期:該產(chǎn)品有效期為12個月。