在反相色譜中隨著pH的增加,酸性化合物保留時間縮短,而堿性化合物延長;
緩沖液可以緩沖溶液pH的改變,緩沖液的定義是加入少量的酸或堿時能緩沖pH,就是說添加酸或堿時pH的變化很小。這個保持pH的能力就叫做緩沖能力,它是由緩沖液的濃度和緩沖鹽的pKa決定的,緩沖鹽在pKa附近的緩沖能力最大。表1列出的是液相中一些常用的緩沖鹽的pKa。注意這是在水中測的,沒有加有機溶劑。當(dāng)加入有機溶劑時,pKa會有所變化,但是通常所有化合物的pKa,包括你的分析物的pKa都會有一樣的變化。
對于液相常用濃度來說,緩沖液應(yīng)維持在緩沖鹽的pKa的1.5個pH單位左右,當(dāng)濃度特別稀的時候,如低于5mM,就要把范圍縮小,大概+/-1個pH單位。
表1:常用緩沖鹽的pKa值(25℃)
緩沖鹽 |
pKa |
醋酸鹽 |
4.75 |
銨鹽 |
9.24 |
硼酸鹽1 |
9.24 |
硼酸鹽2 |
12.74 |
硼酸鹽3 |
13.80 |
檸檬酸鹽1 |
3.13 |
檸檬酸鹽2 |
4.76 |
檸檬酸鹽3 |
6.40 |
2-(N-嗎啉代)乙磺酸(MES) |
6.15 |
草酸鹽1 |
1.27 |
草酸鹽2 |
4.27 |
磷酸鹽1 |
2.15 |
磷酸鹽2 |
7.20 |
磷酸鹽3 |
12.38 |
三氯乙酸 |
0.52 |
三乙醇胺 |
7.76 |
三乙胺 |
10.72 |
三氟乙酸 |
0.50 |
三羥甲基氨基甲烷(Tris) |
8.08 |
建議在開發(fā)方法的時候首先要選擇緩沖鹽和 pH范圍,然后用溶液的選擇性微調(diào)分離。這個策略快速而高效,而且可以讓你避免陷入緩沖液pH的泥潭。
1)建議溫度設(shè)置在25℃-40℃,適當(dāng)?shù)闹鶞乇3至己玫谋A魰r間的重現(xiàn)性,一定程度上提高柱效,增加分離度。
2)柱溫過低,流動相的粘度下降,色譜柱的背壓降低。
3)柱溫太高,與檢測器之間溫差太大,使峰變形,加快離子對試劑或緩沖鹽對硅膠基質(zhì)的攻擊,硅膠溶解,縮短色譜柱的壽命;柱溫太低,使得需要制冷的柱溫箱,硬件要求太高,不利于方法的推廣。
4)溫度的改變會導(dǎo)致保留時間漂移,如果儀器自動進(jìn)樣過夜或過周末,就會發(fā)現(xiàn)保留時間隨著實驗室溫度的改變而產(chǎn)生漂移,顯然這種問題用柱溫箱就可以避免。