聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR技術(shù))又稱無細(xì)胞分子克隆法,它的鼎鼎大名在分子生物學(xué)領(lǐng)域可謂如雷貫耳,近年來無論是如日中天的精準(zhǔn)醫(yī)療,還是穩(wěn)步發(fā)展的基因診斷都離不開PCR技術(shù)這位“老母親”。對于檢驗(yàn)檢測行業(yè)的小伙伴來說,PCR技術(shù)也絕對能夠稱得上是我們的“好幫手”了。尤其是致病菌檢測、動物源性鑒定什么的,PCR君表示毫無壓力。
然而當(dāng)我們真正做好準(zhǔn)備上機(jī)操作時(shí),卻發(fā)現(xiàn)不是那么回事兒,總是有這樣那樣的原因?qū)е聶z測結(jié)果有誤差。今天我們就來好好分析這位“老母親”的脾氣。
PCR反應(yīng)的最大特點(diǎn)是具有較大擴(kuò)增能力與極高的靈敏性,但令人頭痛的問題是易污染,極其微量的污染即可造成假陽性的產(chǎn)生。
下面開始講重點(diǎn)
污染原因
1、標(biāo)本間交叉污染:
標(biāo)本污染主要有收集標(biāo)本的容器被污染,或標(biāo)本放置時(shí),由于密封不嚴(yán)溢于容器外,或容器外粘有標(biāo)本而造成相互間交叉污染;標(biāo)本核酸模板在提取過程中,由于吸樣槍污染導(dǎo)致標(biāo)本間污染;有些微生物標(biāo)本尤其是病毒可隨氣溶膠或形成氣溶膠而擴(kuò)散,導(dǎo)致彼此間的污染。
2、PCR試劑的污染:
主要是由于在PCR試劑配制過程中,由于加樣槍、容器、雙蒸水及其它溶液被PCR核酸模板污染。
3、PCR擴(kuò)增產(chǎn)物污染:
這是PCR反應(yīng)中最主要最常見的污染問題,因?yàn)镻CR產(chǎn)物拷貝量大(一般為1013拷貝/mL),遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于PCR檢測數(shù)個(gè)拷貝的極限,所以極微量的PCR產(chǎn)物污染,就可造成假陽性。
還有一種容易忽視,最可能造成PCR產(chǎn)物污染的形式是氣溶膠污染;在空氣與液體面摩擦?xí)r就可形成氣溶膠,在操作時(shí)比較劇烈地?fù)u動反應(yīng)管,開蓋時(shí)、吸樣時(shí)及污染進(jìn)樣槍的反復(fù)吸樣都可形成氣溶膠而污染。據(jù)計(jì)算一個(gè)氣溶膠顆?珊48000拷貝,因而由其造成的污染是一個(gè)值得特別重視的問題。
4、實(shí)驗(yàn)室中克隆質(zhì)粒的污染:
在分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室及某些用克隆質(zhì)粒做陽性對照的檢驗(yàn)室,這個(gè)問題也比較常見。因?yàn)榭寺≠|(zhì)粒在單位容積內(nèi)含量相當(dāng)高,另外在純化過程中需用較多的用具及試劑,而且在活細(xì)胞內(nèi)的質(zhì)粒,由于活細(xì)胞的生長繁殖的簡便性及具有很強(qiáng)的生命力,其污染可能性也很大。
5、對照試驗(yàn)
a、陽性對照:在建立PCR反應(yīng)實(shí)驗(yàn)室及一般的檢驗(yàn)單位都應(yīng)設(shè)有PCR陽性對照,它是PCR反應(yīng)是否成功、產(chǎn)物條帶位置及大小是否合乎理論要求的一個(gè)重要的參考標(biāo)志。陽性對照要選擇擴(kuò)增度中等、重復(fù)性好,經(jīng)各種鑒定是該產(chǎn)物的標(biāo)本,如以重組質(zhì)粒為陽性對照,其含量宜低不宜高(100以下個(gè)拷貝),但陽性對照尤其是重組質(zhì)粒及高濃度陽性標(biāo)本,其對檢測或擴(kuò)增樣品污染的可能性很大。因而當(dāng)某一PCR試劑經(jīng)自己使用穩(wěn)定,檢驗(yàn)人員心中有數(shù)時(shí),在以后的實(shí)驗(yàn)中可免設(shè)陽性對照。
b、陰性對照:每次PCR實(shí)驗(yàn)務(wù)必做陰性對照。它包括①標(biāo)本對照:被檢的標(biāo)本是血清就用鑒定后的正常血清作對照;被檢的標(biāo)本是組織細(xì)胞就用相應(yīng)的組織細(xì)胞作對照。②試劑對照:在PCR試劑中不加模板DNA或RNA,進(jìn)行PCR擴(kuò)增,以監(jiān)測試劑是否污染。
防止污染的方法
1、合理分隔實(shí)驗(yàn)室:將樣品的處理、配制PCR反應(yīng)液、PCR循環(huán)擴(kuò)增及PCR產(chǎn)物的鑒定等步驟分區(qū)或分室進(jìn)行,特別注意樣本處理及產(chǎn)物的鑒定等步驟分區(qū)或分室進(jìn)行,及PCR產(chǎn)物的鑒定應(yīng)與其它步驟嚴(yán)格分開。
最好能劃分①標(biāo)本處理區(qū);②PCR反應(yīng)液制備區(qū);③PCR循環(huán)擴(kuò)增區(qū);④PCR產(chǎn)物鑒定區(qū)。其實(shí)驗(yàn)用品及吸樣槍應(yīng)專用,實(shí)驗(yàn)前應(yīng)將實(shí)驗(yàn)室用紫外線消毒以破壞殘留的DNA或RNA。
2、吸樣槍:吸樣槍污染是一個(gè)值得注意的問題。由于操作時(shí)不慎將樣品或模板核酸吸入槍內(nèi)或粘上槍頭是一個(gè)嚴(yán)重的污染源,因而加樣或吸取模板核酸時(shí)要十分小心,吸樣要慢,吸樣時(shí)盡量一次性完成,忌多次抽吸,以免交叉污染或產(chǎn)生氣溶膠污染。
3、預(yù)混和分裝PCR試劑:所有的PCR試劑都應(yīng)小量分裝,如有可能,PCR反應(yīng)液應(yīng)預(yù)先配制好,然后小量分裝,-20℃保存。以減少重復(fù)加樣次數(shù),避免污染機(jī)會。另外,PCR試劑,PCR反應(yīng)液應(yīng)與樣品及PCR產(chǎn)物分開保存,不應(yīng)放于同一冰盒或同一冰箱。
4、防止操作人員污染,使用一次性手套、吸頭、小離心管應(yīng)一次性使用。
5、設(shè)立適當(dāng)?shù)年栃詫φ蘸完幮詫φ,陽性對照以能出現(xiàn)擴(kuò)增條帶的最低量的標(biāo)準(zhǔn)病原體核酸為宜,并注意交叉污染的可能性,每次反應(yīng)都應(yīng)有一管不加模板的試劑對照及相應(yīng)不含有被擴(kuò)增核酸的樣品作陰性對照。
6、減少PCR循環(huán)次數(shù),只要PCR產(chǎn)物達(dá)到檢測水平就適可而止。
7、選擇質(zhì)量好的Eppendorf管,以避免樣本外溢及外來核酸的進(jìn)入,打開離心管前應(yīng)先離心,將管壁及管蓋上的液體甩至管底部。開管動作要輕,以防管內(nèi)液體濺出。