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RiboPrinter® 在肉毒梭菌鑒定和分子分型中的應(yīng)用
梭狀芽孢桿菌是一個(gè)多樣化的革蘭氏陽(yáng)性菌屬，專性厭氧，在環(huán)境中普遍存在。這個(gè)屬大約包含了100多個(gè)種，基因組內(nèi)總體的G+C含量范圍在22-55%，反映出該屬內(nèi)的細(xì)菌在系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系上的巨大差異。
該屬內(nèi)最主要的食源性致病菌為肉毒梭菌和產(chǎn)氣莢膜梭菌，它們均可通過(guò)毒素介導(dǎo)，通過(guò)直接產(chǎn)生毒素（如食源性肉毒中毒），或在腸道內(nèi)生成毒素（如嬰兒肉毒中毒和產(chǎn)氣莢膜梭菌腹瀉），從而引發(fā)食源性細(xì)菌性疾病。
肉毒梭菌簡(jiǎn)介
肉毒梭菌（Clostridium botulinum）屬于厭氧性梭狀芽孢桿菌，為革蘭氏陽(yáng)性的多形態(tài)大桿菌，芽孢位于菌體近端，使菌體呈匙形或網(wǎng)球拍狀。根據(jù)抗原性的不同，肉毒梭菌可分為8個(gè)型，分別是A、B、Cα、Cβ、D、E、F和G型。
肉毒梭菌產(chǎn)生的外毒素稱為肉毒神經(jīng)毒素（BoNTs，botulinum neurotoxins），肉毒毒素在目前已知毒素中毒性最強(qiáng)，一個(gè)人的致死劑量大約為1 µg，比氰化鉀毒力大10000倍，和炭疽一樣，可作為生物武器。BoNTs可引發(fā)食物中毒，即肉毒中毒，能夠引起人類中毒的主要型別為A、B和E型。肉毒中毒的臨床表現(xiàn)不同于其他食物中毒，胃腸道癥狀很少見(jiàn)，主要為神經(jīng)末梢麻痹，發(fā)病率不高，但死亡率居細(xì)菌性食物中毒之首。
肉毒梭菌是一種腐物寄生菌，在自然界分布廣泛，食物中肉毒梭菌主要來(lái)源于環(huán)境，如塵埃、糞便等，尤其是帶菌土壤。肉毒梭菌的抵抗力一般，在45℃以上都受到抑制，80℃經(jīng)20min可被殺滅。但其芽孢的抵抗力極強(qiáng)，可耐煮沸長(zhǎng)達(dá)1-6h之久，于180℃干熱5-15min或于120℃高壓蒸汽下10-20min才能滅活，在酒精中可存活2個(gè)月，10%的HCl需60min才能破壞芽孢。蛋白分解型的肉毒梭菌（A、B和F型）芽孢比非蛋白分解型的B、E和F型的芽孢對(duì)熱具有更強(qiáng)的抵抗力。芽孢在厭氧環(huán)境的食品中可發(fā)芽繁殖產(chǎn)生肉毒毒素，人類因食入已產(chǎn)生毒素的食品而發(fā)生肉毒中毒。另外，因肉毒梭菌隨蜂蜜等食物進(jìn)入嬰兒腸道內(nèi)產(chǎn)毒引發(fā)的嬰兒肉毒中毒也有存在。
肉毒梭菌的形態(tài)特征和分類學(xué)
肉毒梭菌為多形態(tài)的厭氧性的桿狀菌，長(zhǎng)約4-6?m，寬約0.6-1.2 ?m，兩側(cè)平行，兩端鈍圓，直桿狀或稍彎曲，可形成芽孢，卵圓形，位于次級(jí)端或偶有位于中央，常見(jiàn)很多游離芽孢，多單在，偶見(jiàn)成雙或短鏈，A型和B型菌的芽孢大于菌體，位于菌體近端，使菌體呈匙形或網(wǎng)球拍狀，其他的型芽孢一般不超過(guò)菌體寬度。有時(shí)呈現(xiàn)長(zhǎng)絲狀或鏈狀，有時(shí)能見(jiàn)到舟形、帶把柄的檸檬形、蛇樣線狀和染色較深的球莖狀，這些屬于退化型，當(dāng)菌體開(kāi)始形成芽孢時(shí)，常常伴隨著自溶現(xiàn)象。肉毒梭菌具有4-8根周生性鞭毛，運(yùn)動(dòng)遲緩，沒(méi)有莢膜。
根據(jù)《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)》，肉毒梭菌歸屬為原核生物界、厚壁菌門、厚壁菌綱、芽孢桿菌科的梭菌屬（Clostridium）。
肉毒梭菌這個(gè)種是基于單一的表型特征，即產(chǎn)生BoNTs的這個(gè)特性來(lái)分類定義的。Collins等（1998）又將其分為4個(gè)組（Group I-IV），這些群呈現(xiàn)出非常多樣化的基因型和表型特征（見(jiàn)表一），菌株之間的差異程度要遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）和金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）菌株之間的差異程度。
這種情況有時(shí)更為復(fù)雜，導(dǎo)致分類學(xué)上的困難，因?yàn)橛行┚陱陌l(fā)育關(guān)系上來(lái)說(shuō)與肉毒梭菌非常相近，但是并不產(chǎn)生神經(jīng)毒素，因而沒(méi)有歸入肉毒梭菌這個(gè)種，如生孢梭菌（Clostridium sporogenes），諾維氏梭菌（Clostridium novyi），和其他一些未命名的梭菌；而有些菌株能生產(chǎn)神經(jīng)毒素，卻因系統(tǒng)發(fā)育較遠(yuǎn)，并未歸入肉毒梭菌，如巴氏梭菌（Clostridium baratii）以及酪酸梭菌（Clostridium butyricum）。更復(fù)雜的情況是，Collins等（1998）還發(fā)現(xiàn)BoNTs的毒力基因能在菌株間不穩(wěn)定地平行轉(zhuǎn)移，從而產(chǎn)生不產(chǎn)毒的變種，或是攜帶部分或未知的BoNTs基因。正因?yàn)槿舛舅缶姆N內(nèi)多樣性，導(dǎo)致了對(duì)于該細(xì)菌的分類學(xué)研究仍存在爭(zhēng)議，給各種肉毒梭菌的檢測(cè)、分離和鑒定方法，甚至是16S測(cè)序法鑒定都帶來(lái)了一定的難度。
表一：肉毒梭菌的基本特征
|
特征 |
組I |
組II |
組III |
組IV |
|
毒素類型 |
A, B, F |
B, E, F |
C, D |
G |
|
人類疾病病原 |
是 |
是 |
是 |
否 |
|
最低生長(zhǎng)溫度（℃） |
10 |
3.3 |
15 |
不確定 |
|
最適生長(zhǎng)溫度（℃） |
35-40 |
18-25 |
40 |
37 |
|
最低生長(zhǎng)pH值 |
4.6 |
5.0 |
5.0 |
不確定 |
|
最低生長(zhǎng)水活度Aw |
0.94 |
0.97 |
不確定 |
不確定 |
|
氯化鈉抑制 |
10% |
5% |
2% |
不確定 |
|
芽孢D100℃值（分鐘） |
25 |
< 0.1 |
0.1-0.9 |
0.8-1.12 |
|
芽孢D121℃值（分鐘） |
0.1-0.2 |
< 0.001 |
不確定 |
不確定 |
|
蛋白分解活性 |
是 |
否 |
否 |
微弱 |
|
脂肪分解活性 |
是 |
是 |
是 |
否 |
|
糖分解活性 |
否 |
是 |
微弱 |
否 |
|
相近的非產(chǎn)毒梭菌屬菌種 |
C. sporogenes C. putrificum |
C. beijerinkii |
C. novyi C. haemolyticum |
C. subterminale C. histolyticum C. linosium |
|
毒力基因位置 |
染色體 |
染色體 |
噬菌體 |
質(zhì)粒 |
|
基因組G+C含量（mol%） |
26-29 |
27-29 |
26-28 |
28-30 |
肉毒梭菌的傳統(tǒng)鑒定和分離方法
正如前述，肉毒梭菌這個(gè)種是基于單一的表型特征，即產(chǎn)生BoNTs的這個(gè)特性來(lái)分類定義的，所以傳統(tǒng)的表型和基因型鑒定方法，如生化反應(yīng)、細(xì)胞脂肪酸組分分析以及16S測(cè)序等并不能給出明確的鑒定結(jié)果，見(jiàn)Collins（1998），Brett（1998），Ghanem（1991）。比如，16S測(cè)序方法已被證實(shí)無(wú)法區(qū)分肉毒梭菌及其兩個(gè)近親：諾維氏梭菌（Clostridium novyi）和生孢梭菌（Clostridium sporogenes）。
肉毒梭菌培養(yǎng)分離的第一步是增菌培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件的確定。培養(yǎng)基可優(yōu)先選用預(yù)還原性（Pre-reduced）厭氧無(wú)菌的熟肉基質(zhì)培養(yǎng)基（可含或不含葡萄糖成分）（cooked meat medium），碎肉葡萄糖淀粉培養(yǎng)基（chopped-meat glucose-starch medium），或胰蛋白胨葡萄糖酵母提取肉湯（tryptone-peptone glucose yeast extract broth）。胰蛋白酶可被添加到配方中以滅活細(xì)菌素和激發(fā)神經(jīng)毒素。溶菌酶的加入有助于復(fù)活熱損傷的孢子，尤其適合于非蛋白分解型肉毒梭菌的菌株。
由于不同組別的肉毒梭菌的最適生長(zhǎng)條件并不統(tǒng)一（見(jiàn)表一），所以最優(yōu)的培養(yǎng)溫度的選擇仍然是個(gè)問(wèn)題。Solomon（2001）等推薦采用28℃用于II組肉毒梭菌的培養(yǎng)，而用35℃用于其他組別的培養(yǎng)，不過(guò)目前已經(jīng)有質(zhì)疑認(rèn)為其不適用魚類和貝殼類食品中肉毒梭菌的檢測(cè)。Anon（1998）等推薦采用30℃用于所有組別的菌株的培養(yǎng)，但在這個(gè)條件下I組的菌株得不到最優(yōu)的生長(zhǎng)。
培養(yǎng)5天后，接種的肉湯需做小鼠生物實(shí)驗(yàn)（Mouse Bioassay）以檢測(cè)BoNTs的產(chǎn)生情況。另需培養(yǎng)10天以檢測(cè)受損芽孢或延遲產(chǎn)芽菌株的生長(zhǎng)情況仍然是十分必要的。所有的培養(yǎng)物還需最終通過(guò)鏡檢檢測(cè)，觀察菌株的形態(tài)特征，以獲得鑒定結(jié)論。
疑似陽(yáng)性的肉湯樣本，連同疑似原因食品和臨床樣本（尤其是糞便）還需選用上述培養(yǎng)基進(jìn)行嚴(yán)格厭氧環(huán)境下的二次培養(yǎng)以進(jìn)行確認(rèn)。培養(yǎng)基需包含以下成分：
卵黃：以檢測(cè)酯酶陽(yáng)性的肉毒梭菌菌株，見(jiàn)Silas（1985）
選擇性抗菌劑：環(huán)絲氨酸，磺胺甲基異惡唑，甲氧芐啶等，見(jiàn)Silas（1985），Dezfulian（1981），Mills（1985）
由于肉毒梭菌不同組別菌株存在較大差異（尤其是I組和II組），專家們一致建議采用含抑菌劑和不含有抑菌劑的選擇性平板同時(shí)進(jìn)行對(duì)照實(shí)驗(yàn)，以便分析和獲得更為準(zhǔn)確的結(jié)果。
典型的肉毒梭菌的菌落形態(tài)見(jiàn)圖一：
Typical colonial growth of C. botulinum, together with an atypical lipase negative culture: Classically, C. botulinum colonies are usually gray-white on blood containing agars with circular irregular edges, and a clear zone of β-hemolysis.
Clostridium botulinum growing on blood agar （Below Left）
Clostridium botulinum growing on egg yolk agar showing the lipase reaction after 72 hours of incubation （Below Right）
主要的肉毒梭菌的生化特征見(jiàn)表二和表三：
表二：各型肉毒梭菌的生化特性
|
型別 |
A |
B |
C |
D |
E |
F |
|
葡萄糖發(fā)酵 |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
|
麥芽糖發(fā)酵 |
+ |
(±) |
(±) |
(±) |
(±) |
(±) |
|
乳糖發(fā)酵 |
- |
- |
(-) |
(-) |
- |
- |
|
蔗糖發(fā)酵 |
(-) |
(±) |
- |
- |
- |
(+) |
|
靛基質(zhì)產(chǎn)生 |
(±) |
- |
(-) |
(-) |
- |
- |
|
明膠液化 |
- |
(+) |
(±) |
(±) |
(±) |
(+) |
|
牛奶消化 |
(+) |
(±) |
- |
- |
- |
(+) |
注：肉毒梭菌的生化形狀并不規(guī)律，即使同型也常見(jiàn)到株間差異；+表示陽(yáng)性，-表示陰性，(±)表示視菌株而定，(+)表示多為陽(yáng)性反應(yīng)，(-)表示多為陰性反應(yīng)。
表三：各組肉毒梭菌的生化特性
|
組別 |
I組 |
II組 |
III組 |
IV組 |
|||||||
|
芽孢位置 |
S |
T |
S |
T |
S |
T |
S |
T |
|||
|
動(dòng)力 |
+ |
- |
+ |
|
+ |
- |
+ |
|
|||
|
有氧環(huán)境 |
- |
|
- |
|
- |
|
- |
|
|||
|
葡萄糖 |
+ |
|
+ |
|
+ |
|
- |
|
|||
|
乳糖 |
- |
|
- |
|
- |
|
- |
|
|||
|
麥芽糖 |
- |
|
+ |
|
d |
|
- |
|
|||
|
甘露醇 |
- |
|
- |
|
- |
|
- |
|
|||
|
卵磷脂酶 |
- |
|
- |
|
- |
+ |
- |
|
|||
|
酯酶 |
+ |
|
+ |
|
+ |
|
- |
|
|||
|
七葉苷水解 |
+ |
|
- |
|
- |
|
- |
|
|||
|
肉渣消化 |
+ |
|
- |
|
+ |
- |
+ |
- |
|||
|
明膠液化 |
+ |
|
+ |
|
+ |
|
+ |
|
|||
|
吲哚產(chǎn)生 |
- |
|
- |
|
- |
+ |
- |
|
|||
|
牛乳反應(yīng) |
d |
|
c |
- |
d |
|
d |
|
|||
|
硝酸鹽還原 |
- |
|
- |
|
- |
|
- |
|
|||
|
脲酶 |
- |
|
- |
|
- |
|
- |
|
|||
注：S表示次端，T表示末端；+表示陽(yáng)性反應(yīng)，-表示陰性反應(yīng)，d表示能消化，c表示凝固。
肉毒梭菌的Ribotyping鑒定及分子分型
正因?yàn)槿舛舅缶姆N內(nèi)菌株的多樣性及其16S序列的高度保守性使得生化鑒定和16S測(cè)序鑒定等傳統(tǒng)技術(shù)對(duì)肉毒梭菌的鑒定存在諸多難點(diǎn)，所以研究者們不遺余力應(yīng)用更多分子生物學(xué)技術(shù)以縮短肉毒梭菌的鑒定時(shí)間，簡(jiǎn)化鑒定流程，增加鑒定結(jié)果的準(zhǔn)確性和重現(xiàn)性。
Ribotyping（核糖體分型）是首個(gè)用于細(xì)菌鑒定和分型的分子指紋技術(shù)，無(wú)需依賴PCR技術(shù)，因此可避免非特異擴(kuò)增問(wèn)題，具有較高的保真性。其是在RFLP（限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性）和Southern Blot印跡基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的一種鑒定和分型方法，它將細(xì)菌的全基因組DNA用限制性內(nèi)切酶消化，經(jīng)電泳分離和Southern Blot轉(zhuǎn)印后，用放射性標(biāo)記的rRNA操縱子探針雜交，根據(jù)帶型和帶數(shù)的多態(tài)性對(duì)細(xì)菌進(jìn)行分子分型，同時(shí)因圖譜本身具備系統(tǒng)分類學(xué)的意義，因此可將圖譜與標(biāo)準(zhǔn)菌株數(shù)據(jù)庫(kù)的指紋模式（Ribo Pattern）進(jìn)行比對(duì)，實(shí)現(xiàn)鑒定和分子分型的同步完成。
該方法的優(yōu)點(diǎn)之一是廣譜性、通用性和特異性兼顧。由于核糖體編碼基因有較高的保守性，各種限制性酶切位點(diǎn)在細(xì)菌基因組內(nèi)也廣泛分布，因此可用一種通用的探針和酶切方案對(duì)多種不同的微生物進(jìn)行檢測(cè)，實(shí)現(xiàn)廣譜分析，特別適合未知病原菌的篩查和溯源，也滿足大規(guī)模檢測(cè)及食物中毒應(yīng)急檢測(cè)的需求。用戶也可為某一特定種屬的細(xì)菌進(jìn)行酶切方案和探針的探索及優(yōu)化，選用單一酶切或混和酶切的條件，及更為特異的探針，滿足更高特異性和分型力的需求，建立個(gè)性化的菌株指紋圖譜數(shù)據(jù)庫(kù)，見(jiàn)Grimont（1986）。
該方法的另一大優(yōu)點(diǎn)是分型力較好。由于核糖體是細(xì)菌體內(nèi)重要的蛋白質(zhì)合成“工廠”，細(xì)菌通常具有多個(gè)核糖體編碼基因以滿足新陳代謝需要。通過(guò)Ribotyping，可獲得足夠數(shù)量不同分子大小的指紋條帶（一般為5~15條），具備較高的分型率和良好的重復(fù)性，分型圖譜穩(wěn)定性高、條帶多，見(jiàn)Anne（1991）。
Schalch等（1997）曾采用Ribotyping技術(shù)對(duì)10個(gè)食物中毒暴發(fā)事件中收集而來(lái)的34株產(chǎn)氣莢膜梭菌（Clostridium perfringens）進(jìn)行了分型，得到了12種指紋模式（Ribotype），且從原因食品中和病人糞便樣本中分離得到的菌株的指紋模式高度吻合。
Hielm等（1999）首次采用Ribotyping技術(shù)對(duì)68株肉毒梭菌和5種相關(guān)的梭菌屬菌種進(jìn)行了鑒定和分型，以考察該技術(shù)對(duì)引發(fā)中毒的肉毒梭菌的鑒定和分型能力。他們先后試驗(yàn)了13種限制性內(nèi)切酶，最終選擇以EcoR I和Hind III的酶切方案進(jìn)行鑒定和分型。這兩種酶切方案及Ribotyping技術(shù)均顯示出了良好的鑒定和分型效果，可以顯著的區(qū)分蛋白分解型和非蛋白分解型的肉毒梭菌菌株，并被推薦為肉毒梭菌種屬鑒定的優(yōu)選方法。
他們隨后用GelCompar軟件對(duì)兩種酶切方案得到的指紋圖譜進(jìn)行了分型力分析以及UPGMA分析。結(jié)果顯示（見(jiàn)表四、圖二和圖三），EcoR I酶切獲得的Ribotyping指紋圖譜分型效果最好，分型指數(shù)（Discriminatory Index）高達(dá)0.982；Hind III酶切的分型能力也相當(dāng)，分型指數(shù)為0.954。聚類分析的結(jié)果顯示，各菌株間的Dice相似系數(shù)為35±13%（中值±標(biāo)準(zhǔn)差）。這些結(jié)果都表明Ribotyping技術(shù)非常適合用于肉毒梭菌的鑒定和分子分型。
Hielm等還認(rèn)為，對(duì)于肉毒梭菌，Ribotyping的分型能力與PFGE（脈沖場(chǎng)凝膠電泳）相當(dāng)，且其圖譜具備PFGE所缺乏的細(xì)菌分類學(xué)意義，因此可用于肉毒梭菌的鑒定，而PFGE圖譜則因其隨機(jī)酶切的性質(zhì)，無(wú)法用于鑒定。另一方面，隨著自動(dòng)化的Ribotyping技術(shù)（杜邦RiboPrinter? System）的問(wèn)世，大大簡(jiǎn)化了鑒定和分型流程，相比繁瑣和對(duì)操作技術(shù)要求較高的PFGE技術(shù)具有顯著的優(yōu)勢(shì)。
表四：Ribotyping技術(shù)用于肉毒梭菌及其他梭菌屬菌株的分型能力分析
圖二：肉毒梭菌EcoR I酶切的Ribotyping指紋圖譜的聚類分析
圖三：肉毒梭菌Hind III酶切的Ribotyping指紋圖譜的聚類分析
自動(dòng)化的Ribotyping技術(shù)已經(jīng)在病原微生物的風(fēng)險(xiǎn)分析和關(guān)鍵點(diǎn)控制（HACCP）體系、GMP體系、食品和藥品安全質(zhì)控和質(zhì)保、常規(guī)檢測(cè)、環(huán)境監(jiān)測(cè)、法規(guī)制定和基礎(chǔ)研究等領(lǐng)域引起了廣泛的關(guān)注并得到了長(zhǎng)足的應(yīng)用。
隨著美國(guó)杜邦公司的RiboPrinter®系統(tǒng)的問(wèn)世，Ribotyping技術(shù)實(shí)現(xiàn)了全自動(dòng)化和標(biāo)準(zhǔn)化（見(jiàn)圖四）。因其出眾的性能、簡(jiǎn)單的操作，RiboPrinter®系統(tǒng)已經(jīng)成為世界眾多微生物學(xué)、分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室開(kāi)展微生物鑒定和分子分型的首選設(shè)備，具備如下特點(diǎn)：
1.高通量，檢測(cè)速度快，鑒定加分子分型8小時(shí)內(nèi)同步完成
2.結(jié)果準(zhǔn)確，重復(fù)性和重現(xiàn)性好
3.廣譜的鑒定和分型能力，未知菌株可直接上機(jī)，無(wú)需預(yù)檢
4.通用試劑盒適用已知和未知細(xì)菌的鑒定和分型，及大規(guī)模篩查和應(yīng)急檢測(cè)需求
5.開(kāi)放平臺(tái)可滿足更高特異性檢測(cè)和個(gè)性化研究需求
6.支持種屬特異試劑盒和多酶切方案滿足更高分型力需求或建立菌株數(shù)據(jù)庫(kù)
7.操作簡(jiǎn)單，自動(dòng)化程度高，標(biāo)準(zhǔn)化流程內(nèi)設(shè)，結(jié)果自動(dòng)判讀，非經(jīng)驗(yàn)豐富人員也只需簡(jiǎn)單培訓(xùn)即可使用，節(jié)省不必要的用地和設(shè)備，人員8.培訓(xùn)更簡(jiǎn)單，成本更低
9.標(biāo)準(zhǔn)數(shù)據(jù)庫(kù)容量為8528個(gè)基因模式，包括1741個(gè)種和297個(gè)屬，標(biāo)準(zhǔn)菌株均來(lái)源ATCC（美國(guó)模式培養(yǎng)物研究所）、JCM（日本微生物菌種保藏中心）和DSMZ（德國(guó)微生物菌種保藏中心）。涵蓋環(huán)境菌（如葡萄球菌、微球菌、芽孢桿菌、梭菌屬等）；致腐菌（芽孢桿菌、假單胞菌、明串珠菌、梭菌屬等）；致病菌（腸出血性大腸桿菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、志賀氏菌、單增李斯特菌、弧菌、彎曲桿菌、阪崎腸桿菌等）；益生菌（乳酸桿菌、雙歧桿菌、乳球菌、嗜熱鏈球菌等）等多種類型
圖四：杜邦RiboPrinter® System全自動(dòng)微生物基因指紋鑒定系統(tǒng)及流程
Bruce等（1995 & 1996）和Webster等（1994）曾證明在沙門氏菌和單增李斯特氏菌菌株分型技術(shù)方面，RiboPrinter?系統(tǒng)比傳統(tǒng)技術(shù)更為有效。
Wiedmann等（1996）曾成功用RiboPrinter®系統(tǒng)追溯到產(chǎn)品和環(huán)境中單增李斯特氏菌的污染，在動(dòng)物源性病原菌疾病暴發(fā)的控制方面起到了積極作用。無(wú)獨(dú)有偶，Bruce等（1996）也成功用RiboPrinter®系統(tǒng)追溯到了食品加工廠環(huán)境中的金黃色葡萄球菌污染。
在Hielm等人的研究基礎(chǔ)上，Skinner等（2000）采用RiboPrinter®系統(tǒng)對(duì)30株肉毒梭菌和1株生孢梭菌的鑒定和分型能力進(jìn)行了進(jìn)一步的研究，獲得了成功。
他們開(kāi)展該工作的原因之一，是因?yàn)镠ielm等（1998）曾報(bào)道，采用PFGE對(duì)非蛋白分解型肉毒梭菌進(jìn)行分型比較困難，很難獲得高質(zhì)量的指紋圖譜。而且在分析B、E、F三型非蛋白分解型肉毒梭菌時(shí)，菌株DNA的降解成了一個(gè)非常困擾的問(wèn)題。而此前，Samore等（1996）已經(jīng)報(bào)道了，在33株難辨梭菌（Clostridium difficile）的分型工作中，PFGE對(duì)其中的23株都沒(méi)有成功分型，推測(cè)的原因也是菌株DNA的意外降解。
這31株各型的肉毒梭菌（見(jiàn)表五）均來(lái)自于美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局和罐頭食品企業(yè)，被接種于改良的厭氧卵黃瓊脂培養(yǎng)基上，在35℃下培養(yǎng)24h。用3mL緩沖液（2 mM Tris + 20 mM EDTA）淋洗平板及用滅菌接種針刮擦平板表面以獲得營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞，制成30µL每管的細(xì)胞混懸液，直接用于RiboPrinter®系統(tǒng)分析，經(jīng)系統(tǒng)自動(dòng)的加熱滅活、裂解、標(biāo)準(zhǔn)EcoR I酶切及后續(xù)分析等流程，獲得了較為理想的結(jié)果。
表五：Skinner等用于分析的肉毒梭菌菌株表
31株菌的分型結(jié)果如表六和圖五所示。Skinner等定義菌株相似度>93%的圖譜被歸為一個(gè)Ribogroup，故31株菌可被分成15個(gè)Ribogroup，并顯示了較高的重現(xiàn)性。其中23株蛋白分解型菌株（含A型和B型），5株非蛋白分解型菌株（B型）和2株E型菌株及1株生孢梭菌均得到了高分辨的分型。
表六：31株肉毒梭菌和產(chǎn)氣莢膜梭菌菌株經(jīng)EcoR I酶切的Ribogroups模式列表
圖五：30株肉毒梭菌經(jīng)EcoR I酶切獲得15組Ribogroup圖譜
Skinner等隨即對(duì)菌株的來(lái)源和菌株的分組進(jìn)行了綜合分析，證實(shí)了RiboPrinter®系統(tǒng)在菌株溯源方面的應(yīng)用價(jià)值，見(jiàn)表七。
表七：部分肉毒梭菌菌株的追溯和圖譜分析
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Ribogroup |
菌株 |
來(lái)源與圖譜分析 |
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128-1 |
CAM3-A, CAM5-B |
來(lái)源于同一個(gè)雞肉蔬菜湯罐頭加工廠，來(lái)自于同一個(gè)生產(chǎn)批次的兩個(gè)罐頭樣本，分型結(jié)果在同一個(gè)Ribogroup |
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137-3 |
OS3-A, 4896-A |
均從1983年美國(guó)伊利諾伊州肉毒梭菌食物中毒事件中收集而來(lái)，其中4896-A來(lái)自病人的糞便，OS3-A來(lái)自于最終確認(rèn)的原因食品——炒洋蔥，這兩株菌不僅被分在了一個(gè)Ribogroup中，且指紋圖譜相似度高達(dá)99% |
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121-7 |
Mush2-B, Mush3-B |
均來(lái)自于1975年同一批次生產(chǎn)的鮮蘑菇，分型結(jié)果在同一個(gè)Ribogroup |
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121-7 |
383-B, 642-B |
來(lái)源于1972-1973年生產(chǎn)的兩個(gè)批次鮮蘑菇樣本，分型結(jié)果在同一個(gè)Ribogroup |
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137-8 |
C. sporogenes PA 3679 |
該生孢梭菌的圖譜與A型肉毒梭菌的相似，從細(xì)菌分類學(xué)上很容易得到解釋，因?yàn)槠渑c組I肉毒梭菌具有相似的培養(yǎng)和生化特征，唯一的區(qū)別是不會(huì)產(chǎn)BoNTs |
從表七中可以看出，來(lái)源相近的肉毒梭菌菌株最終被追溯到同一個(gè)Ribogroup組別（如128-1, 137-3, 121-7,），而生化性質(zhì)與肉毒梭菌接近的生孢梭菌則被分為了一個(gè)新的Ribogroup組別（如137-8），體現(xiàn)了RiboPrinter®系統(tǒng)較好的菌株追溯能力，及干擾菌株的排他能力，這在食物中毒病原體追溯、原因食品追溯、流行病學(xué)調(diào)查、院內(nèi)感染、生產(chǎn)環(huán)境監(jiān)測(cè)和污染源追溯等領(lǐng)域有十分重要的應(yīng)用價(jià)值。
圖六：29株肉毒梭菌經(jīng)EcoR I酶切獲得的9組Ribogroup圖譜
Kennett等（2006）也采用RiboPrinter®系統(tǒng)及EcoR I酶切方案，對(duì)梭菌屬的7種，共計(jì)49株可引發(fā)食源性疾病的梭菌菌株進(jìn)行了鑒定和分型，包括：耐氧梭菌（Clostridium aerotolerans），拜氏梭菌（Clostridium beirjerinckii），腐敗梭菌（Clostridium putrificum），肉毒梭菌，酪酸梭菌，產(chǎn)氣莢膜梭菌和生孢梭菌。Kennett等同時(shí)設(shè)計(jì)了EcoR V酶切方案消化17株肉毒梭菌，以考察不同酶切方案對(duì)鑒定和分型效果的改善作用。結(jié)果證實(shí)RiboPrinter®系統(tǒng)可以較好地鑒定和分型這些梭菌屬的菌株，還可通過(guò)調(diào)整限制性酶切方案來(lái)分型不同表型和產(chǎn)毒型的菌株，可選的限制性內(nèi)切酶除了EcoR I和EcoR V之外，還可選Cla I，Hind III，Spe I，Rsa I等，部分圖譜可見(jiàn)圖六。
綜上所述，杜邦RiboPrinter® System在肉毒梭菌及其他梭菌屬細(xì)菌的鑒定和分子分型領(lǐng)域有著廣闊的應(yīng)用前景和突出的使用價(jià)值。依托杜邦的行業(yè)領(lǐng)先技術(shù)，該鑒定分型產(chǎn)品的技術(shù)路線可有效地保障政府檢測(cè)機(jī)構(gòu)、第三方檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室、研究院所和食品、藥品企業(yè)快速、準(zhǔn)確、標(biāo)準(zhǔn)化地鑒定和分型肉毒梭菌，建立菌株信息庫(kù)，有效追溯污染菌株，從而預(yù)警和控制潛在的肉毒梭菌暴發(fā)和致命食源性疾病發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)。
